異菌脲與戊唑醇、吡唑醚菌酯復(fù)配對(duì) 蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌的聯(lián)合毒力*

鄢海峰，周宗山

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所，遼寧興城 125100）

蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病是世界范圍內(nèi)蘋(píng)果重要病害之一，在我國(guó)各個(gè)蘋(píng)果產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生[1]。蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病主要危害蘋(píng)果葉片，也危害新梢和果實(shí)，是‘新紅星’等元帥系蘋(píng)果的重要病害，在持續(xù)降雨及雨后濕度大的天氣容易暴發(fā)[2-3]，嚴(yán)重時(shí)影響樹(shù)勢(shì)及花芽形成，并且造成大量落葉，影響果實(shí)膨大和著色。在發(fā)病后期，病菌可以侵染果實(shí)，致使果實(shí)品質(zhì)下降，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4-6]。蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病由鏈格孢蘋(píng)果專(zhuān)化型（Alternaria alternata f.sp.mali）引起[7]，殺菌劑抗藥性行動(dòng)委員會(huì)（FRAC）將Alternaria alternata 歸類(lèi)為對(duì)殺菌劑有很高抗藥性風(fēng)險(xiǎn)的植物病原菌，對(duì)生產(chǎn)中使用殺菌劑產(chǎn)生抗藥性有高風(fēng)險(xiǎn)[8]。雖然抗性品種是防控該類(lèi)病害的最經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的方法，但在缺少抗性品種或抗性不完整的情況下，使用化學(xué)藥劑仍是防控作物真菌病害的主要手段[9]。

戊唑醇是麥角甾醇抑制類(lèi)（sterol demethylation inhibitors，DMIs）殺菌劑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛，兼具有保護(hù)、治療的作用[10]。抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究表明，蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌對(duì)戊唑醇敏感性研究結(jié)果有差異，且隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株對(duì)藥劑的敏感性下降[11-12]。二甲酰亞胺類(lèi)（dicarboximides，DCs）包括異菌脲和腐霉利等，是20 世紀(jì)后期開(kāi)發(fā)的一類(lèi)觸殺型保護(hù)性殺菌劑，也具有一定的治療作用，可有效抑制真菌孢子萌發(fā)及菌絲生長(zhǎng)[13]。二甲酰亞胺類(lèi)殺菌劑的廣泛應(yīng)用，很容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，且抗藥性形成時(shí)間短、頻次高[14]，已有DCs殺菌劑在多種病害上產(chǎn)生抗藥性的報(bào)道[15-18]。吡唑醚菌酯是甲氧基丙烯酸酯類(lèi)（quinone outside inhibitors，QoIs）殺菌劑，主要是抑制病菌孢子萌發(fā)及菌絲生長(zhǎng)所需能量的產(chǎn)生，具有內(nèi)吸活性，殺菌譜廣且高效低毒，有保護(hù)、治療、鏟除功能，但作用位點(diǎn)單一，屬“高抗性風(fēng)險(xiǎn)”藥劑[19]。在大量使用該農(nóng)藥的作物上，抗性發(fā)展極為迅速[20]。

為延緩病菌對(duì)殺菌劑的抗藥性產(chǎn)生，開(kāi)展預(yù)防性抗性治理，盡可能延長(zhǎng)殺菌劑的使用壽命，采用不同作用機(jī)制的殺菌劑交替或復(fù)配使用是延緩或阻止病原菌抗藥性加劇的主要策略之一[21]。復(fù)配殺菌劑能形成多位點(diǎn)作用機(jī)制，除了保護(hù)和延長(zhǎng)高效中到高抗性風(fēng)險(xiǎn)殺菌劑的壽命外，復(fù)配殺菌劑還提供了額外的疾病控制水平和范圍[22-23]。在一些作物中，復(fù)配劑的使用在病害防治中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，以維持有效的病害控制和抗性管理[24]。為此，本研究開(kāi)展了篩選異菌脲與戊唑醇、異菌脲與吡唑醚菌酯2 種復(fù)配劑的增效比例，探明戊唑醇與異菌脲、吡唑醚菌酯與異菌脲2 種復(fù)配對(duì)蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌是否具有增效作用，通過(guò)聯(lián)合毒力測(cè)定，最終選出2 種混劑的最佳配比，為研制防治蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌的混配藥劑提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌珠

蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌（Alternaria alternata f.sp.mali）菌株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所植物保護(hù)中心分離、保存。

1.2 試驗(yàn)藥劑

97%異菌脲（iprodione）原藥、85%戊唑醇（tebuconazole ）原藥和95% 吡唑醚菌酯（pyraclostrobin）原藥由沈陽(yáng)化工研究院司乃國(guó)研究員饋贈(zèng)；500 g/L 異菌脲可濕性粉劑由富美實(shí)有限公司生產(chǎn)；430 g/L 戊唑醇懸浮劑由山東煙臺(tái)科達(dá)化工有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 室內(nèi)毒力測(cè)定

（1）單劑毒力測(cè)定。采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌對(duì)異菌脲、戊唑醇、吡唑醚菌酯3 種單一藥劑的敏感性。異菌脲、戊唑醇和吡唑醚菌酯原藥用二甲基亞砜（DMSO）配制成母液備用，將PDA 培養(yǎng)基熔化，冷卻至50 ℃時(shí)加入殺菌劑充分混勻，配制含異菌脲5、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL 系列濃度的PDA 平板，含戊唑醇10、5、1、0.5、0.25 μg/mL 系列濃度的PDA 平板，含吡唑醚菌酯20、10、5、1、0.5、0.25 μg/mL 系列濃度的PDA平板，以不含藥劑的PDA 平板作對(duì)照。在PDA 平板中央接種1 個(gè)直徑5 mm 的菌餅，每個(gè)處理重復(fù)4次，24 ℃下黑暗培養(yǎng)7 d，直角測(cè)量每個(gè)菌落直徑2 次，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。

（2）最佳配比篩選。采用Horsfall 交互測(cè)定法進(jìn)行最佳配比的篩選[25]。異菌脲與戊唑醇2 種單劑用無(wú)菌水分別配制成劑量濃度與其EC50相同或相近的藥液，2 種藥液分別按體積比0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0 進(jìn)行復(fù)配，按照上述單劑毒力測(cè)定方法處理供試菌，以不含藥劑的PDA 平板作對(duì)照，共12 個(gè)處理，1 個(gè)PDA 平板為1 次重復(fù)，每個(gè)處理4 次重復(fù)，異菌脲與吡唑醚菌酯復(fù)配方法及處理同上，計(jì)算各復(fù)配藥劑的菌絲生長(zhǎng)抑制率及毒性比率。

毒性比率小于0.75 時(shí)，表現(xiàn)為拮抗作用；毒性比率在0.75～1.25 時(shí)，表現(xiàn)為相加作用；毒性比率大于1.25 時(shí)，表現(xiàn)為增效作用。根據(jù)毒性比率初步篩選出最佳配比。

（3）混配殺菌劑聯(lián)合毒力測(cè)定。根據(jù)不同比例復(fù)配殺菌劑的毒力結(jié)果篩選出的最佳配比，對(duì)蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌分別取異菌脲與戊唑醇EC50值劑量比例為6∶4、7∶3、8∶2、9∶1，異菌脲與吡唑醚菌酯EC50值劑量比例為6∶4、7∶3、8∶2、9∶1各4 個(gè)比例作聯(lián)合毒力驗(yàn)證，采用Wadley 法進(jìn)行評(píng)價(jià)[26]。

EC50（A）、EC50（B）分別代表混劑中A 藥劑和B 藥劑的EC50實(shí)測(cè)值；EC50（ob）、EC50（th）分別代表混劑的EC50實(shí)測(cè)值和理論值；PA、PB分別代表A 藥劑和B藥劑在混劑中的百分含量，單位為%；SR 代表增效系數(shù)，SR＞1.5 為增效作用，1.5≥SR≥0.5 為相加作用，SR＜0.5 為拮抗作用。

1.3.2 田間藥效試驗(yàn)

2020 年，在遼寧省興城市中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所溫泉試驗(yàn)場(chǎng)蘋(píng)果園進(jìn)行田間藥效試驗(yàn)。試驗(yàn)園為平地，管理一般，蘋(píng)果品種為‘金冠’，行株距5 m×3 m，樹(shù)齡6 年，樹(shù)勢(shì)中庸，蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病常年發(fā)生。

試驗(yàn)藥劑為500 g/L 異菌脲可濕性粉劑和430 g/L 戊唑醇懸浮劑的混合物（異菌脲與戊唑醇的質(zhì)量比為4∶1），濃度分別為3 000 倍液、4 000 倍液、5 000 倍液，對(duì)照藥劑為500 g/L 異菌脲懸浮劑1 500倍液和430 g/L 戊唑醇懸浮劑5 000 倍液，以清水處理為空白對(duì)照。試驗(yàn)共設(shè)6 個(gè)處理，3 株蘋(píng)果樹(shù)為1 個(gè)試驗(yàn)小區(qū)，每個(gè)處理3 次重復(fù)，共18 個(gè)小區(qū)，隨機(jī)區(qū)組安排。用利農(nóng)手壓背負(fù)式噴霧器全樹(shù)噴霧，均勻噴灑。

葉片發(fā)病初期噴第1 次藥，噴藥前調(diào)查發(fā)病基數(shù)，共施藥5 次，間隔7 d，最后1 次噴藥后7 d 調(diào)查防效。病葉分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則》[27]，每小區(qū)隨機(jī)選取10 個(gè)新梢，每個(gè)新梢自上而下調(diào)查全部葉片，記錄總?cè)~片數(shù)、各級(jí)病葉數(shù)，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。對(duì)防效進(jìn)行方差分析（SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件），采用鄧肯氏新復(fù)極差法（DMRT）檢驗(yàn)藥劑平均防效的差異顯著性。

CK 為空白對(duì)照區(qū)施藥后病情指數(shù)，PT 為藥劑處理區(qū)施藥后病情指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 室內(nèi)毒力測(cè)定

2.1.1 3 種殺菌劑對(duì)蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌的毒力

單劑毒力測(cè)定結(jié)果表明，異菌脲、戊唑醇和吡唑醚菌酯3 種單劑對(duì)蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌菌絲生長(zhǎng)均有良好的抑制作用，對(duì)蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌的EC50值分別為0.678 6、2.762 7、7.933 1 mg/L（表1）。

表1 異菌脲、戊唑醇和吡唑醚菌酯對(duì)蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌的毒力

2.1.2 不同比例復(fù)配殺菌劑對(duì)蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌的毒力

復(fù)配劑毒力測(cè)定結(jié)果表明：異菌脲與戊唑醇EC50值劑量比例為6∶4、7∶3、8∶2 和9∶1 時(shí)，對(duì)蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌的毒性比率分別為1.35、1.45、1.50、1.41，表現(xiàn)為增效作用；比例為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6 和5∶5 時(shí)，表現(xiàn)為相加作用。異菌脲與吡唑醚菌酯EC50值劑量比例為9∶1 時(shí)，對(duì)蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌的毒性比率為1.26，表現(xiàn)為增效作用；比例為3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3 和8∶2 時(shí)，均表現(xiàn)為相加作用（表2）。

表2 異菌脲與戊唑醇、吡唑醚菌酯不同復(fù)配比例對(duì)蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌的毒性比率

2.1.3 最佳配比對(duì)蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌的聯(lián)合毒力

結(jié)果表明，異菌脲和戊唑醇不同配比的混合物對(duì)蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌表現(xiàn)不同程度的抑制作用，異菌脲和戊唑醇EC50值劑量比例為8∶2（實(shí)際含量比為4∶1）的增效系數(shù)為1.57，表現(xiàn)為增效作用；比例6∶4、7∶3 和9∶1 配比混劑對(duì)蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌的增效系數(shù)分別為1.27、1.42、1.29，表現(xiàn)為相加作用（表3）。

異菌脲與吡唑醚菌酯EC50值劑量比例6∶4、7∶3、8∶2、9∶1 配比混劑對(duì)蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌的增效系數(shù)分別為1.09、1.12、1.14、1.41，均介于0.5～1.5 之間，表現(xiàn)為相加作用，其中比例9∶1 的增效系數(shù)明顯高于其他3 個(gè)配比（表3）。

表3 異菌脲與戊唑醇、吡唑醚菌酯不同復(fù)配比例對(duì)蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌的聯(lián)合毒力

2.2 田間防治效果

田間試驗(yàn)表明：異菌脲與戊唑醇的復(fù)配劑（質(zhì)量比4∶1）中，稀釋倍數(shù)3 000 的防效最高，為78.90%，顯著高于稀釋倍數(shù)4 000、5 000 的防效和單劑對(duì)照500 g/L 異菌脲可濕性粉劑1 500 倍液、430 g/L 戊唑醇懸浮劑5 000 倍液的防效；異菌脲與戊唑醇的復(fù)配劑（質(zhì)量比4∶1）稀釋倍數(shù)4 000 和5 000的防效分別為73.24%、70.77%，二者差異顯著，也均顯著高于500 g/L 異菌脲可濕性粉劑1 500 倍液、430 g/L 戊唑醇懸浮劑5 000 倍液的防效（表4）。

表4 異菌脲與戊唑醇復(fù)配劑對(duì)蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌的田間防治效果

3 結(jié)論與討論

長(zhǎng)期、連續(xù)地使用單一的殺菌劑會(huì)導(dǎo)致單一作用位點(diǎn)的殺菌劑更快地產(chǎn)生抗藥性，防治成本較高，并且可能致使病害的流行發(fā)展、嚴(yán)重的農(nóng)作物損失，最終導(dǎo)致生產(chǎn)中常用殺菌劑的失效[28]。為降低蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌對(duì)常用殺菌劑產(chǎn)生抗性的風(fēng)險(xiǎn)，擴(kuò)大防治譜及降低使用成本，利用現(xiàn)有農(nóng)藥進(jìn)行混配是有效途徑之一[29]。因此，本試驗(yàn)對(duì)2 種作用機(jī)制不同的殺菌劑的混配進(jìn)行研究，旨在增加藥效，延緩抗藥性的發(fā)生。

室內(nèi)聯(lián)合毒力測(cè)定結(jié)果表明，異菌脲與吡唑醚菌酯復(fù)配在所測(cè)的4 個(gè)EC50值劑量比均對(duì)蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌表現(xiàn)出相加作用，EC50值劑量比例為9∶1（實(shí)際含量比為1∶1）的增效系數(shù)最大。異菌脲和戊唑醇EC50值劑量比為8∶2（實(shí)際含量比為4∶1）的混合物，對(duì)抑制蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌菌絲的生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯增效作用。田間藥效試驗(yàn)結(jié)果表明，異菌脲與戊唑醇復(fù)配質(zhì)量比4∶1 時(shí)，3 000～5 000 倍液的防效顯著高于500 g/L 異菌脲可濕性粉劑1 500 倍液和430 g/L 戊唑醇懸浮劑5 000 倍液的防效，有效成分含量也更低，由此證明這2 種農(nóng)藥具有混配的可行性。

同時(shí)，有報(bào)道稱(chēng)吡唑醚菌酯與戊唑醇復(fù)配對(duì)葡萄炭疽病的防治呈現(xiàn)了明顯增效作用[30]。吡唑醚菌酯與異菌脲的復(fù)配對(duì)防治蘋(píng)果褐斑病菌也表現(xiàn)增效作用[31]。異菌脲與甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑的復(fù)配與單劑相比增效明顯，且擴(kuò)大了殺菌譜[29]。本研究篩選了異菌脲與戊唑醇、異菌脲與吡唑醚菌酯復(fù)配增效比例，結(jié)果表明，異菌脲和戊唑醇以質(zhì)量比4∶1 復(fù)配時(shí)對(duì)蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌增效作用最高，對(duì)蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病的防效隨用藥濃度的增加而提高，推薦使用濃度3 000～4 000 倍液。