‘紅陽’獼猴桃褐斑病病原菌分離鑒定及防治藥劑毒力測定*

冉 飛，張榮全，袁 騰，馬繼玲，尹顯慧，李文志，樊 榮，吳小毛，龍友華

（1 貴州大學農學院，貴陽 550025）（2 貴州大學獼猴桃工程技術研究中心）（3 水城縣東部農業產業園區管理委員會）

獼猴桃屬獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia），在我國資源極為豐富，有中華獼猴桃（Actinidia chinensis）、美味獼猴桃（Actinidia deliciosa）、毛花獼猴桃（Actinidia eriantha）、軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）等62 個種，其中美味獼猴桃和中華獼猴桃栽培利用最為廣泛[1-3]。‘紅陽’（Actinidia chinensis cv.Hongyang）屬中華獼猴桃系列，是一個早熟品種，原產于四川省蒼溪縣，其果實皮薄肉多，香甜可口，果肉顏色鮮美，營養價值豐富[4]，現已列入“國家級品種保護資源”[5]。隨著市場需求的擴大，‘紅陽’獼猴桃在貴州省六盤水地區發展迅速，品質優良，果大端正，為當地經濟特色水果[6]。但近幾年來，該地區‘紅陽’獼猴桃受褐斑病危害極為嚴重，葉片常干枯卷曲，嚴重時可致落葉落果，甚至整株枯死，對‘紅陽’獼猴桃優質高產造成嚴重影響。

植物褐斑病為一種真菌性病害，關于其病原菌的研究主要有危害白及葉片的燕麥鐮刀菌（Fusarium avenaceum）[7]、危害冬瓜葉片的多主棒孢［Corynespora cassiicola（Berk&Curt）Wei］[8]、危害核桃果實的鏈格孢菌（Alternaria alternate）[9]、危害茶葉的格孢腔菌屬真菌（Pleospora camelliae Dippen ）[10]、危害葡萄的葡萄擬尾孢菌（Pseudocercospora vitis）[11]、危害地錦葉片的地錦葉點霉（Phyllosticta partricuspidatae）[12]等。目前關于貴州省‘紅陽’獼猴桃病原菌的研究，有雷霽卿等[13]報道了危害六盤水地區‘紅陽’獼猴桃果實軟腐病的病原菌有葡萄座腔菌（Botryosphaeria sp.）、交鏈孢菌（Alternaria sp.）、擬莖點霉菌（Phomopsis sp.）、小新殼梭孢菌（Neofusicoccum sp.）及間座殼菌（Diaporthe sp.），Li 等[14]雖將六盤水地區‘紅陽’獼猴桃葉片上的褐斑病菌鑒定為 Alternaria tenuissima，但尚未對該病菌開展室內毒力試驗。鑒于此，篩選出高效、低毒的化學藥劑防治‘紅陽’獼猴桃褐斑病至關重要。本研究采取形態學結合分子生物學的方法對貴州省六盤水地區‘紅陽’獼猴桃褐斑病菌進行系統鑒定，并采用菌絲生長速率法研究6 種藥劑對病原菌的抑菌作用，以期為更好地防控‘紅陽’獼猴桃褐斑病提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試病樣

于2019 年7—10 月，多次在貴州省六盤水地區采集典型病葉，帶回實驗室置于4 ℃保存，并于24 h 內進行病原菌分離。

1.1.2 供試培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）[15]，用于病原菌的分離、純化培養及室內毒力試驗。

1.1.3 主要試劑

CTAB 提取液，Taq DNA 聚合酶，引物ITS1（TC CGTAGGTGAACCTGCGG）、ITS4（TCCTCCGCTTAT TGATATGC）、EF1-728F（CATCGAGAAGTTCGAGA AGG）、EF1-986R（TACTTGAAGGAACCCTTACC）、H31-a（ACTAAGCAGACCGCCCGCAGG）和H31-b（GCGGGCGAGCTGGATGTCCTT）等均購自上海生工生物工程技術服務公司。

1.1.4 供試藥劑

97%戊唑醇、96%吡唑醚菌酯、95%苯醚甲環唑、97%咪鮮胺、96%肟菌酯和96%異菌脲，以上原藥均購自湖北正興源精細化工有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 獼猴桃褐斑病病原菌分離、純化及致病力測試

選取典型病害癥狀葉片，用滅菌過的剪刀取其病健交界處4 mm×4 mm 大小的組織塊，先用75%酒精浸泡10～20 s，去除表面張力，隨后放入10%次氯酸鈉消毒1～2 min，再用無菌水清洗3 次，最后用無菌濾紙吸干水分并移入PDA 培養基上，置于28 ℃恒溫培養箱中暗培養。培養3 d 后，挑取典型單菌落邊緣菌絲于PDA 平板上進行多次純化培養，待菌落為純種后，采用30%甘油進行冷凍保存。選取健康獼猴桃葉片，標記接種點，用滅過菌的小刀在接種點輕輕刮傷，再將已培養好的菌株用滅過菌的7 mm 打孔器打成菌餅，用接種針挑取菌餅菌絲面緊貼于葉片，葉柄用無菌水浸濕的棉花包裹，置于28 ℃恒溫培養箱中培養，定期觀察葉片生長情況。待葉片發病后，對發病組織進行再次分離純化，并與原接種菌進行比對。

1.2.2 病原菌培養特征和顯微結構觀察

將已純化菌株轉接于PDA 平板上，置于28 ℃恒溫培養箱中暗培養，參照《真菌鑒定手冊》[16]觀察菌落形態、顏色及生長速度等特征，并在顯微鏡下觀察菌絲、孢子形態和產孢情況。

1.2.3 病原菌總DNA 的提取

采用改良 CTAB 法提取病原菌的基因組DNA[17]。

1.2.4 PCR 序列擴增

采用上海生工生物工程技術服務公司合成的ITS1 和ITS4、EF1-728F 和EF1-986R、H31-a 和H31-b 3 對引物分別對病原真菌的rDNA-ITS、TEF1-α 和Histone 3 基因進行PCR 擴增。擴增產物送至上海生工生物工程技術服務公司進行測序工作。

40 μL PCR 反應體系：2×Taq PCR StarMix 20 μL，正反向引物（10 μmol/L）各2 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 14 μL。

PCR 擴增程序：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，退火30 s（rDNA-ITS：58 ℃，TEF1-α：56 ℃，Histone 3：55 ℃），72 ℃延伸60 s，共32個循環；72 ℃修復延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.5 PCR 擴增產物序列分析

將獲得的各基因序列提交至 NCBI 網站GenBank 數據庫中進行BLAST 比對分析，使用PAUP 軟件建立系統發育樹。

1.2.6 病原菌防治藥劑室內篩選

根據預期試驗結果，利用母液稀釋法將各供試原藥配成5 個有效濃度，戊唑醇終濃度為3.233 3、1.077 8、0.359 3、0.119 8、0.039 9 mg/L，吡唑醚菌酯終濃度為3.200 0、1.066 7、0.355 6、0.118 5、0.039 5 mg/L，苯醚甲環唑終濃度為9.500 0、1.055 6、0.117 3、0.013 0、0.001 4 mg/L，咪鮮胺終濃度為0.692 9、0.099 0、0.014 1、0.002 0、0.000 3 mg/L，肟菌酯終濃度為19.200 0、1.476 9、0.113 6、0.008 7、0.000 7 mg/L，異菌脲終濃度為0.640 0、0.320 0、0.160 0、0.080 0、0.040 0 mg/L，備用。將PDA 培養基加熱熔解，待冷卻至手可以觸碰時，將PDA 培養基與藥劑以9∶1 的比例混合，并倒于培養皿中冷卻凝固。用接種針挑取7 mm 已活化菌餅的菌絲面緊貼于含藥平板中央，密封。以不加藥劑但含等量溶劑的PDA 平板為對照，每處理4 次重復。將接種好的含藥平板倒置于28 ℃恒溫培養箱中暗培養，待對照組菌落生長至整個培養皿的2/3 時，采用十字交叉法測量各處理的菌落直徑，計算平均值和抑菌率。

根據各藥劑濃度和抑菌率在DPS 7.05 統計軟件中求出各藥劑的毒力回歸方程（y＝ax＋b）、相關系數（r）和EC50值。

2 結果與分析

2.1 獼猴桃褐斑病癥狀特征和分離結果

田間調查發現，褐斑病主要危害‘紅陽’獼猴桃的葉片，通常從葉片的邊緣開始侵染，初期為淡褐色斑點，中期病斑逐漸擴大為近圓形或不規則形病斑，病斑中部灰褐色，外圍褐色或深褐色，后期多個病斑融合成大片不規則形，并從葉片邊緣逐漸干枯卷曲，最終脫落（圖版3-A）。通過傳統的組織分離法從病葉典型病斑處分離獲得2 株真菌，分別標記為HBB-5、HBB-8。

2.2 病原菌致病性驗證

根據柯赫氏法則將HBB-5 和HBB-8 2 株真菌分別刺傷接種于離體葉片上，通過觀察可知僅有HBB-8 能使葉片發病，而HBB-5 和對照組在整個培養過程中均不發病。HBB-8 接種于葉片上7 d 后出現可見癥狀（圖版3-B），其發病特征與田間癥狀特征一致，并對葉片發病部位進行了再次分離純化培養。通過形態特征和顯微結構觀察，分離出的菌株與原接種的菌株HBB-8 一致，符合柯赫氏法則，由此表明HBB-8 為引起‘紅陽’獼猴桃褐斑病的致病菌。

2.3 病原菌形態觀察

菌株在PDA 培養基上暗培養，菌落初期為白色，圓形生長，邊緣整齊，2 d 后菌落內圍顏色逐漸加深，后期變為灰色至黑褐色，而外圍仍為白色，培養7 d 后菌落平均直徑為6.53 cm，其氣生菌絲茂密，呈絨狀（圖版3-C-a、b）；分生孢子卵形或倒棍棒形，黃褐色至褐色，具1～4 個橫隔膜，0～2個縱（斜）隔膜，大小為10.02～23.14 μm×4.32～11.25 μm（圖版3-C-c、d）；分生孢子梗直立或稍彎曲，暗色，單支，頂生分生孢子（圖版3-C-e、f）。根據菌株HBB-8 的形態特征觀察，初步鑒定該致病菌為鏈格孢屬真菌[18-20]。

2.4 病原菌分子生物學鑒定

使用真菌通用引物ITS1、ITS4 擴增菌株HBB-8的rDNA-ITS 區域，獲得539 bp 大小的DNA 片段，序列提交至GenBank 數據庫中進行BLAST 比對分析（ITS：GenBank 登錄號為MT358396），發現菌株屬于鏈格孢菌（Alternaria spp.），再通過系統發育樹構建，菌株與細極鏈格孢 A.tenuissima（MN658846、MN685225）和鏈格孢A.alternata（MN659182、MN653245）2 個種以100%的自展支持率聚在同一分支，其他不同屬種則聚在各自的分支上，由此表明，使用rDNA-ITS 基因鑒定不能將A.tenuissima 和A.alternata 2 個種區分開來（圖1）。采用鏈格孢屬真菌常用基因TEF1-α 進行PCR 擴增并比對，HBB-8（TEF1-α：GenBank 登錄號為MW419902）與細極鏈格孢菌株 A.tenuissima（LC136865、LC136863、LC136862 等）的同源性均達到100%，在構建的系統發育樹中也與 A.tenuissima 聚在同一分支（圖2）。再利用另一對引物H31-a 和H31-b 對Histone 3 保守基因進行擴增，由系統發育樹顯示，菌株HBB-8（Histone 3：GenBank 登錄號為MT361348）與A.tenuissima 以很高的支持率聚在一起，而A.alternata 則聚在另一分支上（圖3）。

圖1 菌株HBB-8 基于rDNA-ITS 序列的系統發育樹

圖2 菌株HBB-8 基于TEF1-α序列的系統發育樹

圖3 菌株HBB-8 基于Histone 3 序列的系統發育樹

結合形態學和分子生物學鑒定，最終明確危害‘紅陽’獼猴桃褐斑病的病原為細極鏈格孢（A.tenuissima）。

2.5 6 種藥劑對病原菌菌絲生長的抑制效果

離體抑菌活性測定結果表明，6 種不同藥劑均能有效抑制獼猴桃褐斑病菌菌絲的生長，其抑菌活性由強至弱依次為咪鮮胺＞苯醚甲環唑＞戊唑醇＞異菌脲＞肟菌酯＞吡唑醚菌酯，見表1。咪鮮胺在供試6 種藥劑中對褐斑病菌的抑菌活性最強，EC50為0.008 4 mg/L，其次為苯醚甲環唑，EC50為0.055 3 mg/L。戊唑醇、異菌脲和肟菌酯3 種藥劑對褐斑病菌菌絲生長具有較好的抑制作用，EC50分別為0.163 6、0.164 3、0.168 2 mg/L。吡唑醚菌酯的抑菌效果相對較差，EC50為0.413 7 mg/L。由此可得，咪鮮胺和苯醚甲環唑2 種藥劑對褐斑病菌具有較強的抑制效果，值得用于田間防治該病害。

表1 6 種藥劑對細極鏈格孢菌的抑制效果

3 討論與結論

鏈格孢屬（Alternaria）真菌適應性強，寄主范圍廣，為許多重要植物褐斑病的病原菌，如柑橘[19]蘋果[21]、獼猴桃[18]、核桃[9]、甜葉菊[22]等。鏈格孢屬、小孢子種為一類近似種，僅依靠形態觀察與ITS 序列分析很難明確其具體分類地位[23]。本研究對病原菌的孢子形態和隔膜特征等形態結構進行了觀察，發現其形態特征與趙金梅等[18]、李亞等[19]描述的鏈格孢屬真菌基本一致。采用ITS 結合TEF1-α 和Histone 3 基因對病原菌進行分子鑒定，結果發現，危害‘紅陽’獼猴桃褐斑病的病原菌與細極鏈格孢（A.tenuissima）聚在一起，鑒定結果與Li 等[14]研究結果一致。

褐斑病為獼猴桃的主要病害之一，能貫穿于獼猴桃的整個生長季節，目前生產上對該病害的防控主要以化學防治為主。本研究以6 種保護性殺菌劑原藥為供試藥劑，采用菌絲生長速率法探究其對獼猴桃細極鏈格孢菌的抑菌效果。試驗結果表明，咪鮮胺、苯醚甲環唑、戊唑醇、異菌脲、肟菌酯和吡唑醚菌酯6 種藥劑均具有較強的抑菌活性，其中咪鮮胺和苯醚甲環唑的抑菌活性最強，其EC50分別為0.008 4、0.055 3 mg/L。據報道，400 g/L 氟硅唑乳油、500 g/L 異菌脲懸浮劑、10%多抗霉素B 可濕性粉劑和10%苯醚甲環唑水分散粒劑對中華獼猴桃褐斑病鏈格孢菌（A.alternata）具有較強的抑菌效果[18]；25%苯醚甲環唑乳油、25%咪鮮胺乳油、25%丙環唑乳油、25%嘧菌酯懸浮劑和80%代森錳鋅可濕性粉劑對獼猴桃葉斑病（Pseudocercospora actinidiae Deighton、Phyllosticta sp.）均具有較高的抑菌活性[24]；咪鮮胺錳鹽、戊唑醇、氟硅唑、吡唑醚菌酯、丙環唑、異菌脲對‘紅陽’獼猴桃葉斑病菌（Corynespora sp.）菌絲生長有較強的抑制作用[25]。本研究結果與前人研究結果基本吻合。但本試驗只在室內測定了咪鮮胺和苯醚甲環唑對褐斑病菌有較強的抑菌作用，對于大田防控效果，還有待進一步研究。

咪鮮胺和苯醚甲環唑同為DMI 類殺菌劑，低毒、高效、殺菌譜廣，通過破壞或抑制病菌麥角甾醇的合成，使菌體的細胞膜功能受到損壞，從而達到抑制或干擾病菌孢子和菌絲的形成[26-27]，對多種真菌病害具有較高的保護和治療活性[28-29]。本試驗也驗證了咪鮮胺和苯醚甲環唑2 種藥劑對細極鏈格孢菌具有較強的抑制效果。但目前果樹生產上存在諸多問題，如用藥盲目、農殘超標、環境污染等[30]，為此應加強褐斑病發病規律和病菌致病機理的研究，研發有效生物藥劑，篩選高效拮抗菌株，并結合農業防治措施，開展獼猴桃病蟲害綠色防控。