大孔樹脂純化甜茶多酚及其對 α-葡萄糖苷酶抑制活性和DPPH·抗氧化性的研究

吳婕, 宮江寧

(1.貴州師范學院化學與材料學院, 貴陽 550018; 2.貴州師范大學化學與材料科學學院, 貴陽 550001)

近年來，人工合成藥物的不安全性逐漸被人們認識，尋求無毒副作用的降血糖和抗自由基氧化的藥食同源植物是食品和醫(yī)藥界研究的熱點問題。甜茶(RubussuavissimusS. Lee)是藥食同源植物[1]，也是我國重要的農業(yè)經(jīng)濟型作物。甜茶屬于薔薇科(Rosaceae)懸鉤子屬(RubusL.)植物。甜茶富含氨基酸、微量元素、黃酮類化合物和多酚類化合物等[2]，具有降血糖[3-4]、抗氧化[5]、抗癌和降血壓[6]的藥理功能。

目前，甜茶的降血糖和抗氧化作用機制在細胞[7-8]、動物[9-11]和臨床[12]等實驗中得到了進一步明晰，但尚未見有關不同溶劑萃取大孔樹脂純化的甜茶多酚對 α-葡萄糖苷酶活性和DPPH·自由基的研究。本研究根據(jù)大孔樹脂對甜茶多酚的靜態(tài)和動態(tài)的吸附-解吸性能試驗，優(yōu)化出HPD-826樹脂分離純化甜茶多酚的工藝參數(shù)；分析了HPD-826樹脂純化甜茶多酚以及其萃取物抑制α-葡萄糖苷酶活性和清除DPPH·自由基的效果，找出適合開發(fā)成為ɑ-葡萄糖苷酶抑制劑和抗自由基氧化的抗氧化劑的萃取相，為提高農產品甜茶的經(jīng)濟價值貢獻理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甜茶，購于貴州省健康茶科技有限公司；沒食子酸標準品，購于百倫斯生物技術公司；HPD-826樹脂，購于鄭州和成新材料科技有限公司；LSA-21樹脂，購于和成新材料工廠；D101樹脂和AB-8樹脂，購于滄州寶恩吸附材料科技有限公司。α-葡糖糖苷酶(α-glucosidases)，Sigma-Aldrich Company生產；4-硝基苯酚-α-D 吡喃葡萄糖苷(PNPG), Sigma-Aldrich Company生產；無水乙醇、氫氧化鈉和鹽酸等均為分析純。

UV-2300紫外分光光度計，上海天美科學儀器有限公司生產；KL04A型離心機，湖南凱達公司生產；JL2002型電子天平，淮安金良電子科技有限公司生產。

1.2 大孔樹脂的活化處理

將4種大孔樹脂(HPD-826、LSA-21、D101、AB-8)在5% NaOH溶液中浸泡4 h，洗去堿溶性雜質至中性；在5% HCl溶液中浸泡4 h，洗去酸溶性雜質至中性；用無水乙醇浸泡4 h，洗去醇溶性雜質。大孔樹脂活化后備用。

1.3 大孔樹脂的篩選

向活化好的4種2.0 g樹脂中加入甜茶多酚粗制溶液(100 mL，0.62 mg·mL-1)，振蕩吸附24 h，測定大孔樹脂靜態(tài)吸附后的甜茶多酚質量濃度。用100 mL無水乙醇對吸附飽和的大孔樹脂振蕩解吸24 h，測定大孔樹脂靜態(tài)解吸后的甜茶多酚質量濃度。

本研究中大孔樹脂靜態(tài)吸附-解吸試驗均重復3次，結果取平均值，計算公式如下。

吸附量A=(CⅠ-CⅡ)×VⅠ/MⅠ

(1)

吸附率B=(CⅠ-CⅡ)×100/CⅠ

(2)

解吸率C=CⅢ×VⅡ×100/(CⅠ-CⅡ)×VⅠ

(3)

純度D=CⅢ×VⅡ×100/MⅡ

(4)

式中,A為大孔樹脂對甜茶多酚的吸附量，mg·g-1；B為大孔樹脂對甜茶多酚的吸附率，%；C為大孔樹脂對甜茶多酚的解吸率，%；D為甜茶多酚純度，%；CⅠ、CⅡ、CⅢ分別為初始、吸附后和解吸出的甜茶多酚質量濃度，mg·mL-1；VⅠ、VⅡ分別為粗制樣品體積和洗脫劑乙醇體積，mL；MⅠ為大孔樹脂的質量，mg；MⅡ為經(jīng)過大孔樹脂純化后甜茶的質量，mg。

1.4 HPD-826樹脂動態(tài)吸附-解吸甜茶多酚的研究

將20 mL活化的HPD-826樹脂裝入層析柱中，分析上樣液的質量濃度、體積和上樣流速對HPD-826樹脂吸附率的影響；探討洗脫劑乙醇的體積分數(shù)、洗脫體積和洗脫流速對HPD-826樹脂解吸率的影響。找到HPD-826樹脂純化甜茶多酚的最佳工藝條件。

1.4.1上樣液質量濃度的優(yōu)化 分別將100 mL上樣液(質量濃度1.0、2.0、3.0和4.0 mg·mL-1)以2 BV·h-1流速加入HPD-826樹脂柱中，測定流出液中甜茶多酚質量濃度，得到HPD-826樹脂的吸附率。

1.4.2上樣流速和上樣體積數(shù)的優(yōu)化 將上樣液(100 mL，2.0 mg·mL-1)以不同上樣流速(2和3 BV·h-1)加入到HPD-826樹脂柱中，測定流出液甜茶多酚的質量濃度，得到適宜的上樣流速和上樣體積數(shù)。

1.4.3洗脫液乙醇體積分數(shù)的優(yōu)化 分別將250 mL不同體積分數(shù)(30%、40%、50%、60%和70%)乙醇洗脫液，以2 BV·h-1流速，洗脫飽和HPD-826樹脂柱，測定流出液甜茶多酚的質量濃度，得出HPD-826樹脂的解吸率。

1.5 α-葡萄糖苷酶抑制劑反應體系的篩選

以降低餐后血糖的常見口服降血糖藥阿卡波糖為參照[13-14]，將HPD-826樹脂純化樣品濃縮，分別用乙酸乙酯和三氯甲烷進行萃取，得到乙酸乙酯相萃取物和三氯甲烷相萃取物，測定其α-葡萄糖苷酶抑制率。

參照吳婕等[14]的方法，將α-葡萄糖苷酶(0.2 mL，0.5 U·mL-1)加入到0.2 mL 樣液中，放置在恒溫(37 ℃)水浴鍋中反應(15 min)，在反應混合溶液中加入PNPG(0.1 mL，5 mmoL·L-1) ，繼續(xù)反應 20 min；加入Na2CO3溶液(1.4 L，0.2 moL·L-1)；磷酸鉀緩沖溶液(0.1 mmoL·L-1，pH 6.8)定容10 mL。平行試驗3 次，在402 nm處測定硝基苯的吸光度值，結果取平均值。抑制率計算公式如下。

抑制率Q=[Q空白-(Q樣品-Q背景)]×100%/Q空白

(5)

式中，Q為甜茶多酚對α-葡萄糖苷酶抑制率；Q樣品為待測體系的吸光度；Q空白為不加樣液體系的吸光度；Q背景為不加酶體系的吸光度。

1.6 甜茶多酚抗氧化性研究

配制成不同質量濃度的甜茶多酚樣品，以常見的抗氧化劑Vc為參比，測其吸光度，計算DPPH·清除率。參照崔紫姣[15]的方法，以乙醇(分析純)作為參比，將甜茶多酚樣品放置于暗處30 min，在515 nm處，測其吸光度。加入DPPH·溶液(1.6 mL，0.2 mg·mL-1)，測定吸光度(Z0)；移取1.0 mL甜茶多酚樣品，測定吸光度(Z1)；測定混合液(1.0 mL甜茶多酚樣品+1.6 mL DPPH·溶液)的吸光度(Z2)。DPPH·清除率(Z)的計算公式如下。

DPPH·清除率Z=[1+(Z1-Z2)/Z0]×100%

(6)

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行分析，利用LSD法進行多重比較。采用Origin 11.0制圖。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂吸附-解吸甜茶多酚的效果

由表1可知，不同型號大孔樹脂對甜茶多酚吸附-解吸能力差異較大，由于HPD-826樹脂對甜茶多酚的吸附是通過氫鍵作用，具有最高的平均吸附率(28.1%) 和平均解吸率(99.5%)，故HPD-826樹脂最適合用于純化甜茶多酚。

表1 4種大孔樹脂的靜態(tài)吸附-解吸結果Table 1 Static adsorption and desorption capacity results of four macroporous resins

2.2 HPD-826樹脂動態(tài)吸附-解吸甜茶多酚的優(yōu)化工藝條件

2.2.1上樣液質量濃度 由圖1可知，隨著上樣液質量濃度增加，HPD-826樹脂對甜茶多酚的吸附率表現(xiàn)出先增加后減小的趨勢。當上樣液質量濃度為2.0 mg·mL-1時， HPD-826樹脂對甜茶多酚的平均吸附率最大(92.9%)，因此，最佳上樣液質量濃度為2.0 mg·mL-1。

圖1 上樣液質量濃度對吸附率的影響Fig.1 Effect of sample mass concentration on the adsorption rate

2.2.2上樣流速 當大孔樹脂吸收后的流出液質量濃度為上樣液質量濃度的10%時，即達到大孔樹脂滲漏點[16]。如圖2所示，當上樣流速為2和3 BV·h-1時，HPD-826樹脂的滲漏點對應的累計上樣體積分別在60和50 mL。綜合考慮，應選擇50 mL上樣液和2 BV·h-1流速為宜。

圖2 上樣流速對吸附效果的影響Fig.2 Effect of sample flow rate on the adsorption efficiency

2.2.3洗脫液乙醇體積分數(shù) 圖3顯示，洗脫液體積分數(shù)從30%增加到70%時，HPD-826樹脂對甜茶多酚的解吸率有先增大后減小的趨勢。當洗脫液乙醇體積分數(shù)為60%時，HPD-826樹脂對甜茶多酚的解吸率達到最大值73.1%。因此，本研究中洗脫劑乙醇的最佳體積分數(shù)為60%。

圖3 乙醇體積分數(shù)對解吸率的影響Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on desorption rate

2.3 不同極性溶劑萃取物對ɑ-葡萄糖苷酶的抑制率

ɑ-葡萄糖苷酶抑制劑可以抑制人體ɑ-葡萄糖苷酶的活性，降低餐后血糖值[14]。如圖4 所示，甜茶多酚在一定質量濃度范圍內，其不同極性溶劑萃取物與 ɑ-葡萄糖苷酶的抑制率呈現(xiàn)出正相關關系(R2=0.92～0.98)。若甜茶多酚質量濃度相同時，其不同極性溶劑萃取物對 ɑ-葡萄糖苷酶的抑制率差異較大，其強弱順序依次是：乙酸乙酯相萃取物 > HPD-826樹脂純化樣品 > 阿卡波糖 > 粗制樣品 > 三氯甲烷相萃取物。乙酸乙酯相萃取物、HPD-826樹脂純化樣品、阿卡波糖、粗制樣品、三氯甲烷相萃取物分別對 ɑ-葡萄糖苷酶抑制作用的半數(shù)抑制濃度(IC50)值分別為0.183、1.328、0.379、2.109和79.676 mg·mL-1。由此可見，乙酸乙酯相萃取物和HPD-826樹脂純化樣品對ɑ-葡萄糖苷酶的活性抑制率均優(yōu)于參照物阿卡波糖，其中乙酸乙酯相萃取物最適合開發(fā)成為醫(yī)藥ɑ-葡萄糖苷酶抑制劑。

圖4 不同極性溶劑萃取物對 α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.4 Inhibition rate of α-glucosidase by different polarity solvent extracts

2.4 甜茶多酚對DPPH·的抗氧化性

圖5結果表明，在一定質量濃度范圍內，粗制樣品、三氯甲烷相萃取物、乙酸乙酯相萃取物、參照物Vc與HPD-826樹脂純化樣品具有抗氧化性，均能有效的清除DPPH·。乙酸乙酯相萃取物、參照物Vc、HPD-826樹脂純化樣品、粗制樣品和三氯甲烷相萃取物對DPPH·的半數(shù)抑制濃度IC50值分別為0.060、0.385、0.553、0.729和0.868 mg·mL-1。由此可見，乙酸乙酯相萃取物對DPPH·抗氧化效果最好，適合開發(fā)成抗氧化劑。

圖5 不同樣品的DPPH·清除率Fig.5 DPPH· scavenging rate of different samples

3 討論

3.1 甜茶多酚的純化工藝研究

植物多酚是分子中具有多個羥基的酚類總稱，主要存在于植物的葉和皮中。目前，提取植物多酚可采用溶劑提取法、超聲提取法、微波浸提法和大孔樹脂純化法等；大孔樹脂純化法具有選擇性好、效率高和能耗低等特點[17]。

大孔樹脂是三維網(wǎng)狀結構的高聚物，它對甜茶多酚的吸附-解吸是相互競爭的過程，改變上樣質量濃度、上樣速率和洗脫液的體積分數(shù)等參數(shù)，將影響大孔樹脂的吸附-解吸效果。崔紫姣[15]研究出HPD-100樹脂純化甜茶粗制樣品的最佳上樣液工藝條件(pH 4.0，2.5～5.0 mg·mL-1，2 BV·h-1)，洗脫液乙醇體積分數(shù)30%，得到甜茶多酚純度為63%；林繼元[18]研究 DM-301 樹脂純化甜茶粗制樣品的最佳上樣液參數(shù)(pH 5.5，2 mg·mL-1，1.2 BV·h-1)，洗脫液乙醇體積分數(shù)70%， 甜茶多酚得率為72.1%。

本研究以甜茶多酚為研究對象，對HPD-826、D101、LSA-21和AB-8樹脂進行靜態(tài)吸附-解吸性能的試驗， HPD-826樹脂對甜茶多酚表現(xiàn)出最好的吸附和解吸性能，其平均吸附率和平均解吸率分別為28.1%和 99.5%，因此HPD-826樹脂最適合分離純化甜茶多酚。HPD-826樹脂的動態(tài)吸附試驗結果表明，在相同流速下，隨著上樣液質量濃度的增加，HPD-826樹脂對甜茶多酚的吸附率呈現(xiàn)減小趨勢。這主要是由于甜茶多酚上樣液的質量濃度越高，單位體積內多酚類化合物的分子數(shù)多，多酚類化合物與HPD-826樹脂的接觸量越大，傳質速率降低；同時單位體積內增加的雜質量會與多酚類化合物形成競爭，導致HPD-826樹脂對多酚化合物吸附率降低。若選擇上樣液質量濃度2.0 mg·mL-1，其平均吸附率達到最大值92.9%。上樣流速是影響HPD-826樹脂吸附甜茶多酚的重要因素之一；當上樣流速為2和3 BV·h-1時，HPD-826樹脂對應的累計上樣體積分別為60和50 mL，此時出現(xiàn)滲漏點。考慮工業(yè)生產效率，選擇50 mL上樣液和2 BV·h-1流速為宜。HPD-826樹脂對甜茶多酚的解吸率會隨著洗脫液乙醇體積分數(shù)的增加表現(xiàn)出先增加后減小的趨勢，當乙醇體積分數(shù)為60%時，HPD-826樹脂對甜茶多酚解吸率可以達到最大值73.1%。因為當洗脫劑乙醇的體積分數(shù)較低時，它對甜茶多酚的洗脫不完全，得到的解吸率較低；當洗脫劑乙醇的體積分數(shù)較高時，其極性反而降低，溶出的極性較小的醇溶性雜質會與甜茶多酚類化合物形成競爭，降低甜茶多酚類化合物與乙醇-水分子結合的可能性，導致其解吸率降低[17-18]。綜上所述， HPD-826樹脂優(yōu)化的動態(tài)工藝參數(shù)：上樣液質量濃度、上樣液體積和上樣流速分別為2.0 mg·mL-1、50 mL和2 BV·h-1；洗脫劑乙醇體積分數(shù)、洗脫液體積、洗脫流速分別為60%、250 mL和 2 BV·h-1。在此優(yōu)化條件下，甜茶多酚的平均純度可以達到81.2%。

3.2 甜茶多酚不同萃取物對 α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

α-葡萄糖苷酶抑制劑可以和人體小腸的α-葡萄糖苷酶的中心活性部位結合，阻止餐后高血糖[16]。許多流行病學調查結果顯示，飲茶能夠降低血糖的水平和降低患糖尿病風險，具有α-葡萄糖苷酶抑制劑的作用。Wu等[19]探討了綠茶提取物在雄性 SD大鼠中對糖耐量的影響，發(fā)現(xiàn)綠茶水溶性成分可以提高胰島素活力，具有明顯的降血糖功效。Sabu等[20]研究表明，綠茶多酚能夠抑制脂質過氧化，具有清除氧自由基和羥自由基等能力，降改善肝腎功能和低血糖水平，改善糖尿病病情。

不同極性溶劑萃取的甜茶多酚，其多酚類化合物結構差異較大，降糖效果也不同。本研究結果表明，在一定甜茶多酚質量濃度范圍內(0.1～0.9 mg·mL-1)，阿卡波糖、乙酸乙酯相、HPD-826樹脂純化樣品和粗制樣品對ɑ-葡萄糖苷酶都有較好的抑制效果, 呈現(xiàn)出良好的“劑量-效率”正相關關系；當甜茶多酚質量濃度相同時，乙酸乙酯相和HPD-826樹脂純化樣品對α-葡萄糖苷酶的活性抑制作用均優(yōu)于參照物阿卡波糖，乙酸乙酯相萃取物對應的抑制率最高，這主要是由于乙酸乙酯相富集了最多的抑制α-葡萄糖苷酶的茶多酚。因此，經(jīng)過HPD-826樹脂純化的甜茶多酚乙酸乙酯萃取物具有開發(fā)成α-葡萄糖苷酶天然抑制劑的巨大潛力，后續(xù)的工作重點將對乙酸乙酯萃取物中的單體進行分離和分析，明確結構和藥效的關系。

3.3 甜茶多酚不同萃取物對DPPH·的抗氧化性研究

天然植物的活性提取物的體外抗氧化能力檢測通常使用DPPH·清除率檢測法[14]。HPD-826樹脂純化樣品、粗制樣品、三氯甲烷相萃取物和乙酸乙酯相萃取物對DPPH·均有較好的清除能力，其強弱順序為：乙酸乙酯相萃取物 > 參照物Vc> HPD-826樹脂純化樣品> 粗制樣品 >三氯甲烷相萃取物。在一定質量濃度范圍內，DPPH·清除率均隨著三氯甲烷相萃取物、粗制樣品、HPD-826樹脂純化樣品和乙酸乙酯相萃取的質量濃度增加而提高，其中DPPH·清除率對乙酸乙酯相萃取物質量濃度的響應最靈敏(IC50值僅為0.06 mg·mL-1)。因此，經(jīng)過HPD-826樹脂純化的甜茶多酚乙酸乙酯萃取物具有開發(fā)成天然抗氧化劑的巨大潛力，拓寬甜茶深加工領域，推動甜茶區(qū)經(jīng)濟持續(xù)快速的發(fā)展。