奇崗微繁技術建立及幼苗耐鹽性評價

王曄，陳慧萍，李潤枝，彭真，范希峰，武菊英*，段留生，2*

（1.北京農學院，植物科學技術學院，北京102206；2.中國農業大學農學院，植物生長調節劑教育部工程研究中心，北京100193；3.北京市農林科學院，北京草業與環境研究發展中心，北京100097）

奇崗（Miscanthus×giganteus）是禾本科芒屬（Miscanthus）多年生草本植物，來源為二倍體芒（Miscanthus sinensis）和四倍體荻（Miscanthussacchariflorus）自然雜交形成的三倍體雜交種［1］，原產于日本，在歐洲作為主要能源植物廣泛種植，后來也作為園林觀賞植物，逐漸散布于各地。奇崗因具有光合效率強、水分養分利用效率高［2］；生物產量高、纖維品質好、灰分含量低［1-2］；抗旱耐寒、入侵性低、邊際土地生長能力強［3］等優點備受關注，除了可以觀賞，也可以用于飼料、制造優質紙漿、建筑材料和發電等［2］，是一種具有巨大潛在利用價值的節水型觀賞植物和能源植物。

奇崗作為異源三倍體，結實率很低，難以利用種子繁殖，主要通過根狀莖繁殖［4］，但繁殖速度很慢，種植成本較高且不利于運輸和保存，嚴重影響了其推廣和研究［5］。利用組織培養技術不僅繁殖系數高、周期短、可產生大量植株，是一種方便、快捷、有效的繁殖手段，也是近期國內外研究芒屬植物繁殖的熱點方向［6］。目前國外已有奇崗微繁的相關報道，主要集中在外植體選擇［7-8］、不同培養基的組合［9］、生長調節劑對愈傷組織誘導和植株再生的影響［10］及微生物接種促進幼苗生長能力［2］等方面，但尚未建立規模化應用的奇崗微繁技術體系，繁殖效率仍然較低，成本較高，尚難以滿足大面積種植需要［11］。

我國目前對奇崗的微繁技術研究較少，同時我國大量邊際性土地和園林綠化用地存在鹽堿或鹽漬化的問題，奇崗幼苗能否在高鹽土壤上生長還缺乏研究。本研究在國外研究成果基礎上，從腋芽生枝途徑建立奇崗微繁技術，評價試管苗生長對鹽脅迫的耐性，以期建立簡單經濟、繁殖系數高的奇崗無性繁殖體系，為利用稀缺材料高效培育高質量種苗，加快奇崗推廣應用和在鹽漬化土地利用提供理論和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

奇崗（M.×giganteus）于2004年種植于中國農業大學西校區校內試驗地（40°01′N，116°36′E）和北京草業與環境研究發展中心試驗基地（39°34′N，116°28′E）。

1.2 試驗方法

試驗以MS為基本培養基，在MS培養基中添加5.0 mg·L-16-芐氨基嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA）、0.25 mg·L-1萘乙酸（1-naphthalene acetic acid，NAA）、750.0 mg·L-1MgCl2·6H2O、20.0 g·L-1蔗糖和3.0 g·L-1Gelrite，pH為5.5～5.8。培養溫度為（26±1）℃，光照/黑暗16 h/8 h，光照強度35μmol·m-2·s-1。

1.3 外植體消毒和選材

1.3.1 外植體消毒 選取處于旺盛生長階段的奇崗莖稈，去除葉片，截取莖節上下1.5 cm莖段，在超凈工作臺上采用下列4種方法消毒，D1：用0.1%氯化汞（HgCl2）浸泡20 min；D2：1.5%HgCl2浸泡5 min；D3：1.0%次氯酸鈉（NaClO）浸泡20 min；D4：用75%酒精噴灑表面后，再用1.0%NaClO浸泡20 min。選取所有的方法消毒完畢后，均用無菌水沖洗3次以上，用無菌濾紙吸去水分后接種。每個處理10瓶，每瓶接種5個莖段外植體，重復3次。培養10 d后統計污染率（污染率=污染個數/接種個數×100%）和出芽率（出芽率=未污染出芽個數/未污染接種個數×100%）。

1.3.2 外植體選材 選取完全展開葉片數為5～6片、8～9片和10片時的健壯生長的植株，去除葉片，保留葉鞘，取莖節上下1.5 cm莖段，根據1.3.1試驗結果，選擇消毒方法。每個處理10瓶，每瓶接種5個莖段外植體，重復3次。培養10 d后統計出芽率和增殖倍數（增殖倍數=增殖后的莖段數/接種的莖段數）。

1.4 誘導和繼代培養基的篩選

選取完全展開葉片數為5～6片的植株，將無菌莖段分別接種到加入含不同濃度6-BA的培養基中：1）1.0 mg·L-16-BA；2）3.0 mg·L-16-BA；3）5.0 mg·L-16-BA；4）7.0 mg·L-16-BA。每個處理10瓶，每瓶接種5個莖段外植體，重復3次。每隔30 d繼代一次，統計繁殖系數（繁殖系數=繼代后獲得的莖段數/原有莖段數×100%）。

1.5 生根培養

選擇繼代培養獲得的生長健壯的叢生莖接種到加入5.0 g·L-1活性炭的1/2 MS培養基中，以不添加活性炭為對照，每個處理10瓶，每瓶接5叢，重復3次，培養30 d后統計根數、根長和發根植株的株高等。

1.6 耐鹽適應性

采用水培試驗，在中國農業大學光照培養室中進行，光照強度為600μmol·cm-2·s-1，光照/黑暗時間為16 h/8 h，晝/夜溫度為（25±2）°C/（15±2）°C，相對濕度為60%～70%。選取生長健壯的試管苗移栽到1/2 Hongland培養液中，培養7 d后，在全營養液中再培養7 d后進行鹽脅迫處理。加入NaCl濃度分別為0、0.2%、0.4%、0.6%和0.8%。每處理移栽10株，重復3次。每隔4 d更換一次培養液，保持24 h通氣。

1.7 數據處理與分析

采用Excel 2010軟件進行數據整理，用SAS 8.0統計軟件的ANOVA法進行差異顯著性分析，用Duncan’s法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 莖段外植體消毒方法篩選

不同消毒方法對莖段外植體腋芽發生誘導率和污染率影響較大（表1），其中，1.0%NaClO浸泡20 min處理的誘導率較高（72.5%），但其污染率（12.5%）顯著高于其他處理（P＜0.05）；1.5%NaClO浸泡20 min處理消毒效果雖好，但對植株組織傷害較大，降低了誘導率（23.3%）。對植株組織先用70%酒精噴灑表面，再用1.0%NaClO溶液浸泡20 min消毒效果最佳，沒有污染，且誘導率高達85.2%。

表1 莖段外植體消毒方法篩選Table 1 Screening of sterilization methods for explants of nodal segments（%）

2.2 莖段外植體生長時期的選擇

由表2可以看出，在相同培養條件下，外植體的取材時期不同，出芽誘導率也受到影響。不同取材時期的可用外植體數差異不顯著。隨著葉齡的增加，出芽率降低，增殖倍數也呈降低趨勢。當在5～6葉取材時，外植體出芽率最高為83.95%，增殖倍數為3.98。因此，綜合比較，5～6葉時期取材（圖1A），增殖效率最高，8～9葉期和10葉以上取材繁殖效率較低。

圖1 奇崗微繁植株再生體系Fig.1 Plant regeneration system of M.×giganteus

表2 不同取材時期對增殖倍數的影響Table 2 Effects of nodal segments developmental stage on bud induction rate and proliferation multiples

2.3 培養基優化

由表3可見，莖段接入添加6-BA的MS誘導培養基后，在30 d時統計腋芽發生（圖1B），不同濃度6-BA對奇崗出芽誘導率沒有顯著影響（82.75%～84.09%）。隨著繼代培養基中添加6-BA濃度增加，繁殖系數呈先增高后降低趨勢。當6-BA濃度較低，為1.0 mg·L-1時，繁殖系數最低，但出芽誘導率高；當6-BA濃度為5.0 mg·L-1時，繁殖系數較其他濃度6-BA處理顯著增加；6-BA濃度為3.0和7.0 mg·L-1時繁殖系數差異不顯著。相同濃度6-BA處理，對一代（30 d）、二代（60 d）和三代（90 d）間繁殖系數影響不顯著。由此可見，6-BA濃度5.0 mg·L-1為適宜濃度，每繼代一次，一個莖段平均可增加2～3個幼芽，繁殖系數平均可達341.67%。

表3 不同濃度6-BA處理對莖段外植體出芽率和繁殖系數的影響Table 3 Effects of different 6-BA levels on bud induction rate and multiplication coefficient of nodal segments explants

2.4 生根培養

將增殖培養后的奇崗叢生芽（圖1C）轉移至生根培養基中進行生根培養。培養基中加入活性炭，生根率、幼苗株高和根數與對照相比無顯著差異（表4）。平均根長與對照相比，提高了1.5倍，且達顯著水平，而且根的質量提高，變得柔軟不易折斷，移栽時成活率提高了1.1倍，減少了移栽失敗造成的人力物力浪費從而提高了經濟效益。

表4 活性炭對奇崗生根壯苗的影響Table 4 Effects of activated carbon on the rooting and transplantation of M.×giganteus

2.5 不同NaCl濃度對微繁苗生長速率和生物量的影響

試管苗經煉苗移栽至不同NaCl濃度的水培營養液中，隨著培養液中NaCl的濃度增加，微繁苗生長速率呈降低趨勢（表5）。脅迫處理7 d，NaCl濃度大于0.2%，植株生長速率顯著減慢，但仍能存活。脅迫處理14 d后，0.8%濃度的NaCl處理植株逐漸枯萎死亡；0.4%和0.6%濃度的NaCl處理使植株生長速度緩慢，根開始變軟，變褐，均表現出鹽害現象，但是兩者的生長速率差異不顯著；當NaCl濃度為0.2%時，與對照相比，植株根系發生量多，根系較硬，較長，也有小的腋芽發生，且生長速率和生物量與對照相比差異不顯著。

表5 不同NaCl濃度對奇崗微繁苗生長速率和生物量的影響Table 5 Effects of differ ent NaCl concentrations on the gr owth r ate and fr esh weight of M.×giganteus

3 討論與結論

3.1 外植體及消毒方法對奇崗微繁效果的影響

外植體的生理狀態、生長周期、可用數目、誘導率都是影響繁殖效率的重要因素。奇崗組織培養在腋芽發生途徑的微繁中常以莖節［12］和莖尖［13］為外植體。由于莖尖器官幼嫩對取材和消毒處理要求較高，且一個植株只能獲得一個莖尖，繁殖系數低。以莖段為外植體時，操作簡便易行，但不同生長期的莖段對微繁效果和幼苗質量有一定影響。本研究用不同葉齡的莖段微繁發現，5～6葉齡奇崗植株的莖段做外植體出芽率和增殖系數均最高；5葉齡前的莖段物質積累較少，微繁成苗率低、幼苗長勢弱；8葉齡后奇崗下部莖節木質化程度逐漸增加，再取莖段培養誘導率低，消毒處理比較困難。

不同消毒劑濃度和處理時間對奇崗微繁過程中污染率和誘導率影響較大。Nielsen等［12］采用1.5%NaClO浸泡20 min消毒莖段，誘導率較低；Lewandowski［13］先用70%酒精浸泡3 s，再用1.5%NaClO浸泡5 min對外植體消毒，莖段污染率高，且褐化嚴重。本研究對莖段外植體用75%酒精噴灑表面后再用1.0%NaClO浸泡20 min，獲得了較好的滅菌效果，同時保證了較高的誘導率。

3.2 不同植物生長調節劑和活性炭對奇崗微繁效果的影響

植物生長調節劑是微繁培養基中的關鍵物質，其種類、用量和組合對培養物的誘導分化起重要作用［14-16］。本研究結果表明，6-BA濃度為5.0 mg·L-1時，莖段增殖率最高，為362.58%，當6-BA濃度達7.0 mg·L-1時，莖段開始出現玻璃化，可見，6-BA的誘導作用顯著，不僅能促進細胞分裂膨大，也利于莖生長、側芽發生及增殖，但高濃度則有抑制作用［17-18］。綜合誘導率和繁殖系數，在腋芽生枝途徑微繁體系培養基中6-BA適宜濃度范圍為3.0～5.0 mg·L-1，但各濃度下均未產生根系。

活性炭具有極高的吸附能力被廣泛應用于植物組織培養中，本試驗添加5.0 g·L-1活性炭顯著提高了根系質量，有利于培養壯苗。莫遠琪等［19］研究發現活性炭濃度在1.0～2.0 g·L-1對澳洲鴿子石斛（Dendrobium kingianum）的株高和葉片數生長有促進作用，但根數和根長變化不大。馬麗娜等［17］研究新塔花（Ziziphora bungeana）組織培養中發現添加0.1%～0.2%活性炭與生長素配比使用達到壯苗效果，生根植株長勢較好，推測一定濃度的活性炭吸附了植株生根培養時產生的酚類物質，說明活性炭在植物生根培養過程中起著重要作用。同時還能將培養基變黑提供類似土壤的暗化條件，有利于離體生根和根生長［20］。

3.3 奇崗微繁移栽苗的耐鹽性評價

鹽脅迫會使植株正常生長發育受到嚴重限制，成活率降低且株體生長量銳減［21］。林聰［21］對芒屬植物進行田間鹽脅迫研究中發現南荻（Miscanthuslutarioriparia）在輕度（平均含鹽量0.4%）和中度（平均含鹽量0.5%）鹽堿地上耐鹽能力均較強，而對奇崗的耐鹽能力沒有涉及。本試驗發現對奇崗微繁試管苗進行NaCl脅迫處理14 d，0.8%NaCl濃度下微繁苗逐漸枯萎死亡；低于0.8%的NaCl脅迫處理，植株生長速率雖受到抑制，但仍然存活，與段鈞譯等［22］對奇崗幼苗NaCl脅迫下的表現一致。說明在較高鹽濃度條件下奇崗微繁苗能夠正常生長，具有較強的耐鹽性。