基于SLAF-seq技術開發芋肉纖維顏色性狀的分子標記

孫亞林 王直新 季 群 劉玉平 黃新芳 朱紅蓮 柯衛東

（武漢市農業科學院蔬菜研究所，湖北武漢 430207）

芋（Colocasia esculenta）為天南星科芋屬多年生單子葉草本植物。園藝學上可分為魁芋、多子芋和多頭芋等幾種栽培類型。芋主要食用其地下球莖，糧菜兼宜。魁芋中有一類因芋肉（即地下球莖可食用部分）纖維顏色呈現出紫色檳榔花紋而被稱作檳榔芋，以品質優良聞名海內外，在我國廣西、廣東、福建、湖南等地區廣泛栽培（丘培姣和鐘玉芳，2015；董偉清 等，2019）。

檳榔芋一般栽培條件下很少開花，主要依靠球莖無性繁殖。目前生產上檳榔芋一般采用地方品種，品種結構較為單一。近年來，已陸續開展了芋的赤霉素開花誘導和雜交育種工作（孫亞林 等，2010；劉獨臣 等，2017），Quero-García 等（2006a）研究表明有性雜交是選育優質、抗病、高產的芋新品種最有效的方法。目前，SSR、SRAP、SNP 等已廣泛應用于蔬菜品質性狀的分子標記研究中（饒立兵 等，2015；劉哲 等，2016），但關于芋品質性狀的分子標記報道較少。Quero-García 等（2006b）構建了芋的第一張遺傳圖譜，找到了與芋產量、球莖直徑相關的QTL 位點，同時鑒定了控制芋肉黃色性狀的基因，認為其受1 對顯性基因控制。

芋肉纖維顏色主要有白、黃、棕、紫等（黃新芳和柯衛東，2006），其中芋肉纖維呈紫色被認為與芋球莖的品質緊密相關，因而最受市場歡迎。Lebot 等（2017）研究表明芋肉紫色纖維中含有10種黃酮類物質，具有抗氧化、消炎和保護神經等保健功能。芋肉纖維顏色易識別，且能穩定遺傳，在芋遺傳育種中可作為理想的形態標記；但芋生長周期長，該性狀只有在芋球莖成熟收獲后才能進行鑒定，費力耗時，因此開發芋肉纖維顏色性狀的分子標記具有重要的育種價值。

SLAF-seq（specific length amplified fragment sequencing）是一種基于限制性內切酶和高通量測序技術的基因分型策略，通過對特定片段進行二代測序獲得海量的、多態性標簽序列來充分代表目標物種的全基因組信息（Sun et al.，2013）。該技術具有步驟簡單、成本低、高通量的優點，已在SNP分子標記開發和遺傳圖譜構建等領域得到廣泛的應 用（Luo et al.，2016；Ye et al.，2016）。目 前，通過SLAF-seq 技術在芋上開發特異分子標記的相關研究尚未見報道。本試驗利用SLAF-seq 技術獲取了與芋纖維顏色性狀緊密關聯的多態性SLAF 標簽，進而開發出一批特異性強、穩定性好的SNP標記，以期為芋分子標記輔助育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2017年1—8 月在武漢市江夏區國家種質武漢水生蔬菜資源圃露地進行，以國家地理標志產品荔浦芋（芋肉纖維呈紫色）為母本（P1），樂平野芋（芋肉纖維呈黃色）為父本（P2），通過赤霉素誘導開花雜交得到F1，再由F1自花授粉獲得包含272 個單株的F2群體。球莖成熟后分別對父母本、F1及每個F2單株的球莖進行縱切，對芋肉纖維顏色進行田間鑒定。

1.2 DNA 提取以及混池構建

選取母本荔浦芋和父本樂平野芋各5 株，并從F2群體中經芋肉纖維顏色鑒定篩選出顏色紫色和黃色植株各40 株。采用CTAB 法提取每個單株幼嫩葉片的DNA。采用1%瓊脂糖電泳和紫外分光光度計檢測基因組DNA 的完整性和純度。然后將父本樂平野芋5 株、母本荔浦芋5 株、F2群體中芋肉纖維紫色和黃色極端表型的40 個單株的DNA 分別等量混合，至終濃度為40ng·μL-1，形成4 個混池，用于SLAF-seq 建庫測序。

1.3 酶切建庫

利用限制性內切酶對檢測合格的4 個混池的基因組DNA 分別進行酶切，對得到的酶切片段（即SLAF 標簽）進行3′端加A 處理、連接Dualindex 測序接頭（Kozich et al.，2013）、PCR 擴增、純化、混樣、切膠選取目的片段，文庫質檢合格后用Illumina HiSeqTM2500 進行上機測序。因芋尚無參考基因組序列信息發布，為評估酶切試驗的準確性，選用水稻品種日本晴（Oryza sativaL.japonica.cv.Nipponbare）為對照進行測序（International Rice Genome Sequencing Project，2005）。日本晴基因組大小為374.31 Mb，其序列下載地址為http：//rice.plantbiology.msu.edu。測序由北京百邁克生物科技有限公司完成。

1.4 SLAF 標簽和SNP 標記開發

測序產生的reads 來源于同一限制性內切酶對不同樣品作用產生的長度相近的酶切片段，根據序列相似度將各樣品的reads 進行聚類，聚類到一起的reads 來源于一個SLAF 片段（SLAF 標簽）。同一SLAF 標簽在不同樣品間的序列相似度遠高于不同SLAF 標簽間的相似度；在不同樣品間序列有差異（即有多態性）的SLAF 標簽，即可定義為多態性SLAF 標簽。

1.5 關聯分析

通過混池間的基因型頻率差異進行標記關聯分析，尋找混池之間基因型頻率的顯著差異，用Δ（SNP index）統計（Abe et al.，2012）。SNP 與性狀的關聯度越強，Δ（SNP index）越接近于1。由于芋目前尚無參考基因組序列，以0.999 分位點0.9 作為與性狀顯著關聯的閾值，大于該閾值的標記則為與性狀顯著關聯的標記。

1.6 分子標記的開發及穩定性檢測

利用Primer Premier 5.0 軟件，針對關聯到的SNP 位點設計AS-PCR（allele specific PCR，等位特異性PCR）引物，引物3′端與模板互補或錯配，并在3′端的第2 或第3 位人為引入錯配堿基，該錯配堿基與3′末端的錯配堿基共同作用，減少引物與其3′末端不互補的模板之間的錯誤延伸。根據與芋肉纖維顏色顯著關聯的SNP 位點共設計42組引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR反應體系共25μL，含100ng·μL-1模板DNA1μL、2×Taqmix12.5μL（含Taq酶、dNTP、Mg2+）、10μmol·L-1正向和反向引物各1 μL、ddH2O9.5μL。PCR 反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，45～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35 個循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 遺傳分離群體的構建

以芋肉纖維紫色的荔浦芋為母本，芋肉纖維黃色的樂平野芋為父本，雜交獲得F1，然后自交構建F2分離群體。在F2群體中芋肉紫色纖維密集程度呈現連續變化（圖1），表明芋肉纖維顏色為數量性狀。為了開發芋肉纖維顏色的分子標記，在F2群體中篩選芋肉纖維紫色和黃色材料各40 份，用于BSA（bulked segregant analysis）分析。

2.2 測序數據統計與評估

用限制性內切酶EcoR Ⅴ和ScaⅠ對芋基因組進行酶切，酶切片段長度在364～464 bp 的序列定義為SLAF 標簽。為保證分析質量，采用100 bp 雙端測序進行后續的數據評估和分析。通過對水稻日本晴測序數據的評估監控試驗過程是否正常，確定酶切方案實施的有效性。

利用Illumina HiSeqTM2500 平臺進行測序，共獲得37.65 Mb reads 數據，對各樣品的測序數據進行評估（表1）。測序后各樣品所獲的reads 數目在3 909 833～13 575 917 范圍內，測序質量值Q30為94.41%～95.21%，均在90%以上，說明測序堿基錯誤率低，所獲數據合格。測序獲得GC 含量的范圍在39.59%～40.28%。

表1 各樣本測序數據統計結果

2.3 SNP 位點開發及關聯分析

SLAF 標簽親本平均深度為44.43×，混池平均深度為57.62×。其中父本的測序深度為55.78×，母本的測序深度為33.09×，aa 池的測序深度為54.01×，ab/bb 池的測序深度為61.22×（表2），累計開發了293 363 個SLAF 標簽。采用GATK 軟件檢測SNP 位點，共得到134 372 個SNP，其中芋肉纖維紫色的母本得到107 190 個SNP，芋肉纖維黃色的父本得到124 912 個SNP，芋肉纖維紫色混池得到128 317 個SNP，芋肉纖維黃色混池得到130 247 個SNP。SNP 雜合率為19.31%～70.86%。

表2 SLAF 標簽和SNP 位點統計

在SNP-index 關聯分析前，需要先對134 372個SNP 進行過濾，過濾掉有多重突變的SNP 位點共358 個，再過濾掉混池中read 支持度小于4 的位點38 642 個，再過濾掉混池中基因型一致的位點共12 239 個，再過濾掉親本中不存在的SNP 位點共25 423個，最終獲得57 710個SNP用于后續分析。

采用SNP-index 方法計算關聯值，以0.999 分位點0.9 作為閾值，篩選出與性狀關聯程度較顯著的27 個SNP 位點（表3）。

表3 與芋肉纖維顏色性狀連鎖的SNP 標記

2.4 芋肉纖維顏色相關連鎖分子標記的開發

根據關聯分析獲得的SNP 標記，共設計42組引物開展篩選。通過對纖維紫色、黃色和雙親的基因組DNA 模板進行AS-PCR 擴增，結果表明，Marker44764（引物序列Marker44764-F：5′-GCTATTCAGTTCTATGTTGATTACC-3′，Marker44764-R：5′-CATCACACCAGGACCTCTA C-3′）能較好地區分芋肉纖維顏色性狀，在母本和F2中芋肉纖維紫色的單株中均能擴增出245 bp 的特異條帶，父本和F2中18 個芋肉纖維黃色的單株均不能擴增出特異條帶，僅有2 個芋肉纖維黃色的F2單株擴增出了條帶，該標記在F2分離群體中的檢出率達到95%（圖2），表明該標記與芋肉纖維顏色性狀緊密連鎖，可用于芋雜交后代的苗期分子標記輔助選擇。

3 討論

3.1 SLAF-seq 測序技術應用

SLAF-seq 技術是對傳統BSA 方法的升級，可在全基因組水平進行SNP 掃描，相比SSR、AFLP、RAPD 等傳統分子標記技術，無論從標記數量，還是穩定性等方面，SLAF-seq 技術都具有無可比擬的優勢。該技術同時適用于沒有參考基因組的作物，能有效克服基因組復雜、序列與標記信息缺乏等問題，可在較短時間內完成較高深度的簡化基因組測序和大規模SNP 標記開發。目前，SLAFseq 技術已廣泛應用于小麥、大豆、油菜、甜瓜等多種作物（張紅 等，2015；Xia et al.，2015；Geng et al.，2016；Yin et al.，2018），并取得了顯著的效果。如杜龍崗和王美興（2018）通過SLAF-seq 技術對玉米果皮纖維素含量進行研究，對親本和重組自交系群體的極端單株混池進行SLAF 測序，共獲得73 786 個SLAF 多態性標簽，檢測到523 395 個SNP 位點，獲得6 個控制玉米果皮纖維素含量的染色體區段，并確定了9 個候選基因。

目前，芋參考基因組序列尚未公布，利用常規方法開發與芋特定性狀連鎖的分子標記耗時長、難度大。本試驗通過SLAF-seq 技術，共獲得37.65 Mb 的reads 數據，從293 363 個SLAF 標簽上開發獲得57 710 個高質量的SNP 位點，從中篩選到27個與芋肉纖維顏色性狀緊密關聯的差異標記。

3.2 關于芋肉纖維顏色性狀的分子標記輔助選擇

Ivancic 等（2003）對702 份芋雜交后代各性狀進行調查，并進行表型性狀關聯分析，相關性分析結果表明，芋肉顏色和芋肉纖維顏色可以通過對葉柄基部的顏色和葉柄下部（基部上方2～3 mm）的顏色進行評分來確定，可以在植株生長前期完成，加快循環選擇過程。但該方法也存在局限性，如果親本基因型改變，雜交后代的評分模型可能會發生改變，導致結果出現錯誤。通過分子標記輔助篩選可以克服這個問題，首先，分子標記不受環境、親本基因型的影響；其次，選擇效率更高，分子標記輔助選擇可以在苗期進行，可在早期對目標性狀進行篩選，省時省力。分子標記輔助選擇可極大提高選擇的效率，加速作物的遺傳改良（Collard &Mackill，2008）。本試驗是國內進行芋品質性狀分子標記開發的首次嘗試。利用SLAF-seq 技術篩選出與芋肉纖維顏色性狀緊密關聯的SNP 位點27個，通過AS-PCR 技術進行SNP 位點多態性驗證，獲得了1 組引物，具有良好基因分型效果。分子標記與之前的形態標記相比，特異性、靈敏度、穩定性均顯著提高。通過對40 個單株進行檢測驗證，結合田間鑒定結果，其準確率達到95%，能極大地提高育種選擇效率。

4 結論

通過SLAF-seq 技術測序獲得芋37.65 Mb 的數據，基于293 363 個SLAF 標簽，開發了57 710個高質量的SNP 位點。篩選到27 個與芋肉纖維顏色性狀緊密關聯的SNP 位點。通過AS-PCR 技術進行SNP 位點多態性驗證，其中Marker44764 操作簡單、穩定性好，能有效實現芋肉纖維顏色早期基因分型，可對芋育種材料進行苗期的分子標記輔助選擇，提高芋雜交育種的單株選擇效率。