低溫脅迫下不同耐寒性葉用芥菜的生理差異分析

王玉賢 姚培杰 袁穎輝 楊文杰 萬正杰*

（1 華中農業大學園藝林學學院，湖北武漢 430070；2 中國農業大學農學院，北京 100193）

芥菜（Brassica junceaCoss.）是起源于中國的特色蔬菜，為十字花科蕓薹屬常異花授粉的一年或兩年生草本植物。其中，葉用芥菜包括分蘗芥、大葉芥等11 個變種，在西南、華南、華中、華東等地種植約100 萬hm2（萬正杰 等，2018）。葉用芥菜喜冷涼，生長適溫為15～22 ℃，溫度低于12 ℃時生長受阻。我國長江流域以及西南地區芥菜類蔬菜以越冬栽培或者高海拔栽培為主，冬季極端氣候（雪災和凍害）的頻繁發生和高海拔冷涼氣候極大地影響了芥菜的生長發育，因此篩選耐寒芥菜資源，培育耐寒芥菜新品種是我國芥菜類蔬菜育種的主要目標。目前芥菜的研究多集中在葉色、葉形、抗病性、耐旱性及雄性不育等遺傳和育種領域，有關芥菜耐寒的生理特性研究鮮有報道。

低溫脅迫是非生物脅迫因子之一，嚴重影響植物的生長發育。植株在低溫脅迫下生長緩慢，葉片萎蔫失綠，結實率下降，產量和品質雙重降低（馬驪 等，2016；張磊 等，2017）。而植物會啟動一系列響應機制來應對低溫環境，涉及植物細胞膜結構和功能的變化，細胞內電子傳遞、酶活性、原生質體的變化以及一些超微結構如類囊體的磷酸化等（Theocharis et al.，2012）。姚悅梅等（2017）研究表明，低溫脅迫下羽衣甘藍葉片的相對電導率、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、可溶性蛋白含量和脯氨酸含量顯著增加。楊碧云等（2019）研究表明，低溫脅迫下紫色普通白菜（小白菜）的PS Ⅱ光化學活性受到抑制、光合速率下降，影響其光合作用能力。白陽陽（2017）研究表明，可通過增強光合性能、抗氧化能力及滲透調節能力來提高甜菜幼苗自身耐寒性。關于芥菜在低溫脅迫下的生理變化未見報道，但探明其生理機制對選育耐寒芥菜新品種卻尤為重要。

本試驗通過對400 份芥菜自交系的田間篩選，得到2 個具有明顯耐寒性差異的葉用芥菜自交系。以這2 個自交系為研究對象，分別進行4 ℃低溫和22 ℃常溫處理，分析其在生長情況、光合作用能力、抗氧化酶活性、滲透調節物質含量等方面的差異，以期為選育耐寒葉用芥菜新品種提供理論依據和實踐支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從全國各地芥菜栽培區和科研院所收集芥菜自交系共400 份，于2017年9 月25 日在華中農業大學蔬菜育種基地播種，小區面積2.5 m2，隨機區組排列，3 次重復。2018年1 月8—11 日出現連續低溫天氣，最低氣溫達-7 ℃（圖1），田間400 份芥菜自交系表現出明顯的生長差異（圖2），其中大葉芥自交系18J381（圖2-A）葉片萎蔫、皺縮，甚至腐爛，不耐低溫；分蘗芥自交系18J380（圖2-F）植株挺拔，葉片舒展，葉色微黃，耐寒性較強。18J381 來源于廣東省地方品種廣東客家芥，18J380來源于浙江省地方品種細葉排菜。這2 個自交系的耐寒性及生長情況差異明顯，選用于后續生理指標差異分析。

1.2 試驗方法

試驗于2018年11 月至2019年3 月在華中農業大學園藝植物生物學教育部重點實驗室進行。18J381 和18J380 種子分別播于裝有育苗基質（泥炭∶園藝蛭石∶珍珠巖=2V∶1V∶1V）的營養缽（高8 cm，上口徑7 cm，下口徑5 cm）中，壓穴播種深度0.3 cm，每穴2 粒。育苗缽置于組織培養室內，環境條件為：光周期16 h/8 h（光照/黑暗），光照強度500μmol·m-2·s-1，空氣相對濕度70%，出苗前溫度25 ℃，出苗后22 ℃；出苗后及時間苗，加強苗期管理，待幼苗第3 片真葉完全展開、第4 片真葉剛長出時，選取長勢整齊一致的幼苗移至人工氣候箱中進行低溫脅迫處理。低溫處理溫度為4 ℃，對照溫度為22 ℃，光照條件和相對濕度與組織培養室相同。每處理幼苗24 株，3 次重復。

低溫處理3 d 后，2 個葉用芥菜自交系的幼苗長勢出現明顯差異，拍照記錄各處理幼苗的形態，并取樣測定各項生理指標。

1.3 項目測定

每處理隨機選取4 株幼苗，用去離子水洗凈、擦干，從根莖部剪斷，利用天平稱量地上部鮮質量，記為W1；然后置于80 ℃烘箱烘干至恒重，稱量干質量，記為W2。

每處理隨機選擇3 株幼苗，取自下往上數第3片真葉，采用電導儀法測定相對電導率（王學奎，2006），采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定丙二醛（MDA）含量（王學奎和黃見良，2015），采用考馬斯亮藍G-250 法測定可溶性蛋白含量（李合生，2000），采用茚三酮法測定游離脯氨酸含量（孔祥生和易現鋒，2008）；采用氮藍四唑（NBT）法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性（Giannopolitis &Ries，1977），采用愈創木酚法測定過氧化物酶（POD）活性（李合生，2000），采用紫外吸收法測定過氧化氫酶（CAT）活性（王學奎，2006），采用紫外比色法測定抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性（中國科學院上海植物生理研究所和上海市植物生理學會，1999）；暗適應30 min 后，采用Imaging-PAM 熒光成像儀測定光系統Ⅱ最大光化學量子產量（Fv/Fm）、實際光化學量子產量（ΦPS Ⅱ）、非光化學猝滅系數（NPQ）和光化學猝滅系數（qP）（Lu et al.，2003）。

1.4 數據處理

試驗數據采用Microsoft Excel 2010 軟件整理和計算，并進行單因素方差分析。其中，以百分數為結果的數據先進行反正弦轉換，再進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對不同耐寒性葉用芥菜幼苗生長的影響

如圖3 所示，4 ℃低溫處理3 d 后不耐寒的大葉芥自交系18J381（廣東客家芥）葉片萎蔫、下垂，且葉片發黃，老葉受損害程度較重；耐寒性強的分蘗芥自交系18J380（細葉排菜）植株依舊挺拔直立，未出現葉片失水萎蔫情況，葉片略有泛黃跡象。2 個葉用芥菜自交系的實驗室低溫處理表現與田間表現一致。

2.2 低溫脅迫對不同耐寒性葉用芥菜幼苗相對含水量、相對電導率和MDA 含量的影響

從表1 可以看出，低溫脅迫下2 個葉用芥菜自交系的幼苗相對含水量均顯著下降；與各自對照相比，18J381 和18J380 相對含水量分別下降了3.13和2.22 百分點，不耐寒的大葉芥自交系18J381 相對含水量的降低幅度大于耐寒性強的分蘗芥自交系18J380。說明低溫脅迫下耐寒性強的葉用芥菜的持水能力要強于不耐寒的葉用芥菜，這與生長形態觀察結果一致。低溫脅迫下18J381 葉片相對電導率和MDA 含量均顯著升高，分別比相應對照升高了20.24 百分點和25.0%。而18J380 的葉片相對電導率雖有上升，但與相應對照差異不顯著；MDA 含量比相應對照顯著增加，增幅45.5%，表明低溫脅迫導致2 種葉用芥菜幼苗的細胞膜均受損；與不耐寒的18J381 相比，耐寒性強的18J380 受損程度較輕，細胞內含物外滲較少。

表1 低溫脅迫對不同耐寒性葉用芥菜幼苗相對含水量、相對電導率和MDA 含量的影響

2.3 低溫脅迫對不同耐寒性葉用芥菜幼苗葉綠素熒光參數的影響

葉綠素熒光參數能夠更為直觀和準確地反映植物光合系統的工作效率。如圖4 所示，低溫脅迫導致18J381 葉片光合能力不均勻下降，與葉片中央相比，葉緣處熒光成像對應的參數值變化顯著，光合作用的抑制尤為嚴重。從表2 可以看出，與相應對照相比，低溫脅迫下18J381 的光系統Ⅱ最大光化學量子產量（Fv/Fm）、實際光化學量子產量（ΦPS Ⅱ）、非光化學猝滅系數（NPQ）和光化學猝滅系數（qP）均顯著下降；而18J380 的ΦPS Ⅱ和qP 雖與相應對照相比顯著下降，但降幅小于18J381，Fv/Fm 則與相應對照差異不顯著，NPQ值升高。表明低溫脅迫下不耐寒的大葉芥自交系18J381 光合能力受到的抑制更為嚴重。

2.4 低溫脅迫對不同耐寒性葉用芥菜幼苗抗氧化酶活性的影響

從表3 可以看出，與各自對照相比，低溫脅迫下18J380 的SOD、POD 和CAT 活性均顯著上升，分別增加了46.93%、45.65%和18.59%。而18J381的SOD 活性無顯著差異；POD 和CAT 活性顯著上升，且上升幅度高于18J380；APX 活性的上升幅度亦高于18J380，但與其相應對照無顯著差異。以上結果表明18J380 的SOD 活性顯著上升對于耐寒性的增強起著重要作用。

2.5 低溫脅迫對不同耐寒性葉用芥菜幼苗可溶性蛋白和游離脯氨酸含量的影響

從表4 可以看出，低溫脅迫下18J381 的可溶性蛋白和游離脯氨酸含量均比相應對照顯著增加；而18J380 的可溶性蛋白含量與相應對照無顯著差異，游離脯氨酸含量的增加幅度明顯高于18J381。說明低溫脅迫下耐寒性強的18J380 通過積累更多的游離脯氨酸來進行滲透調節，從而提高自身耐寒性。

表4 低溫脅迫對不同耐寒性葉用芥菜幼苗可溶性蛋白和游離脯氨酸含量的影響

3 結論與討論

本試驗結果表明，4 ℃低溫脅迫下不耐寒的大葉芥自交系18J381 相對含水量下降幅度比耐寒性強的分蘗芥自交系18J380 大，這與幼苗的生長狀況表現一致。但是18J381 的葉面積比18J380 大，因此散失的水分可能較多，故還需要測定葉片蒸騰速率等指標進一步明確緣由。低溫脅迫對2 種葉用芥菜幼苗的細胞膜造成了一定的損傷，MDA 含量和相對電導率均呈上升趨勢，但18J381 的相對電導率上升幅度更大，細胞內含物外滲較多，細胞膜的結構和功能受到更加嚴重損傷。

葉綠素熒光參數動力學技術是一種測定植物光合系統工作效率的方法，其參數值可以反映植物光系統吸收、轉化、傳遞、利用光能的情況（王曉黎 等，2011）。Fv/Fm 代表植物潛在的光合作用能力，ΦPS Ⅱ代表植物的實際光合效率，NPQ 反映植物的光保護能力大小，qP 反映植物光合活性的高低。研究表明，植物在逆境中Fv/Fm、ΦPS Ⅱ和qP 值下降，而為了避免過剩光損傷NPQ 值會升高（Gorbe &Calatayud，2012；許耀照 等，2019）。本試驗中，低溫脅迫下耐寒性強的18J380 的Fv/Fm 和NPQ 與相應對照差異不顯著，且NPQ 值升高；而不耐寒的18J381 的4 個參數均比對照顯著下降，尤其是NPQ 值下降說明低溫直接導致其熱耗散保護能力下降。Fv/Fm 值下降表明植物在低溫下發生光抑制（張渝潔，2008），也表明發生光抑制的點位于PS Ⅱ（張立濤 等，2009），PS Ⅱ反應中心的失活導致電子傳遞活性大幅度降低，植物的光合作用機制遭到破壞。因此低溫抑制18J381 光合活性的原因可能是低溫抑制了光合作用酶的活性，PS Ⅱ復合物需要同化的光能增加，而植株本身將過剩光能轉化為熱能耗散的能力下降，電子傳遞鏈產生過剩的電子，累積較多的活性氧，對反應中心色素蛋白造成損傷，使PS Ⅱ的活性受到抑制（張磊 等，2017）。

抗氧化酶系統是植物抗逆研究中最為普遍的指標。植物在逆境脅迫中會產生過多的活性氧對自身造成危害，活性氧清除系統的工作效率與抗氧化酶的活性有關（Keutgen &Elke，2008）。本試驗結果表明，低溫脅迫下耐寒性強的18J380 的SOD 活性顯著升高，上升幅度高于不耐寒的18J381，這與在黃瓜和甘藍幼苗上的研究結果一致（秦文斌 等，2018；Lee &Lee，2000）；而18J381 的POD 和CAT活性上升幅度高于18J380，與前人研究的西葫蘆葉片酶活性升高幅度越大植株耐寒性越強的規律相反（毛麗萍 等，2009），這可能是由于酶活性的變化較復雜，受取樣時間和環境等因素的影響，今后將對這兩個指標與芥菜耐寒性的關系進一步進行試驗驗證。

低溫環境下植物細胞內會生成大量的滲透調節物質，來緩解或避免細胞失水和細胞冷凝（Per et al.，2017）。可溶性蛋白和游離脯氨酸都具有較強的親水性，能增加細胞的持水能力，保護細胞結構不受損傷。本試驗中，低溫脅迫下2 個葉用芥菜自交系幼苗的可溶性蛋白和游離脯氨酸含量均升高，這與在白菜型冬油菜和甘藍型油菜上的研究結果一致（李世成 等，2007；蒲媛媛，2010）。18J380 可溶性蛋白含量的增加幅度低于18J381，但游離脯氨酸含量的增加幅度明顯高于18J381，說明其主要是通過積累游離脯氨酸來增強對低溫環境的適應性。

綜上，與不耐寒的大葉芥自交系18J381 相比，耐寒性強的分蘗芥自交系18J380 能夠更有效地響應低溫脅迫，增強抗氧化酶活性、提高滲透調節能力以減輕自身細胞損傷，維持較強的光合作用能力。推測相對電導率、葉綠素熒光參數Fv/Fm 和NPQ 值、SOD 活性以及游離脯氨酸含量可作為初步篩選耐寒芥菜的生理指標。今后將對本試驗篩選出的葉用芥菜耐寒生理指標在其他類型葉用芥菜品種中展開驗證，以進一步明確葉用芥菜耐寒性生理機制的規律性和普遍性。