茄子菌核病病原菌鑒定及抗性種質資源篩選

李韋柳 吳永官 甘桂云 蔣雅琴 玉 寧 李文嘉 黎 炎 康德賢 王益奎

（廣西農業(yè)科學院蔬菜研究所，廣西蔬菜育種與新技術研究重點實驗室，廣西南寧 530007）

近年來隨著茄子生產的規(guī)模化和設施化，菌核病危害呈逐年加重趨勢，在廣西，每年4—8 月是菌核病發(fā)生較重的時期，造成的茄子產量損失達10%～35%，嚴重地塊減產達60%（莫賤友 等，2011）。目前對菌核病的防治以施用化學殺菌劑為主，但該方法成本高、易造成環(huán)境污染，且因長期大量使用化學藥劑，易產生耐藥菌株，導致一些傳統(tǒng)藥劑（如多菌靈）防治效果不理想（喬昕 等，2016），培育抗病品種是防治菌核病最安全、有效的措施之一，因此，通過抗性鑒定挖掘抗性資源顯得尤為重要。目前，對菌核病抗性種質的鑒定研究多見于大豆（王金生 等，2009；董利東 等，2014）、油菜（冉毅 等，2007；劉玲彥，2013；馬田田 等，2014；何烈干 等，2018）、花椰菜（孫溶溶 等，2011）以及煙草（高崇 等，2018）等作物上，并獲得了相應的抗性資源作為轉育材料或直接應用于生產（Ding et al.，2015），而茄子資源抗性鑒定研究鮮見報道。

茄子菌核病是由子囊菌門盤菌綱核盤菌屬的核盤菌〔Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary〕引起的一種真菌病害，又稱白霉病、軟腐病、莖腐病等（鐘仕田，1987）。核盤菌是最具破壞性的土壤真菌病原體之一，寄主植物廣泛，可侵染多達75 個科600 多種植物種類（Boland &Hall，1994；Liang &Rollins，2018）。研究表明，核盤菌在茄子整個生育期都能侵染危害，苗期主要發(fā)病部位在莖基部，初呈水漬狀淺褐色斑，后變棕褐色，使病苗呈立枯狀死亡，成株期莖、枝、花、果、葉均能受害，大多數(shù)從植株莖部距地面5～30 cm 的主莖或側枝處開始發(fā)病再上下擴展（鐘仕田，1987；莫賤友 等，2011）。核盤菌的菌核可萌發(fā)溫度為10～30 ℃，溫度高于20 ℃有利于菌絲型萌發(fā)，菌絲生長最適溫度為20～25 ℃（李麗麗 等，1986；Huang &Kokko，1989；孫敬賢和張魯剛，2015；母紅巖 等，2017），廣西6—8 月的最低氣溫普遍高于25 ℃，茄子菌核病的發(fā)生較為普遍。不同核盤菌小種在不同寄主上的致病性和病癥不盡相同（Choudhary &Prasad，2012；Nahar et al.，2019），明確病原菌種類是開展科學防控的基礎。本試驗對廣西高溫高濕條件下發(fā)生的茄子菌核病采用形態(tài)學、分子生物學方法進行病原菌種類鑒定，并采用田間接種鑒定方法對茄子資源進行抗性篩選，為菌核病的科學防控及抗病育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

參試茄子種質材料共42 份，5 種類別，其中高級栽培茄25 份、初級栽培茄（Meyer et al.，2012）5 份、紅茄6 份、野生茄3 份，遠緣雜種3 份，均由廣西農業(yè)科學院蔬菜研究所提供。各種質形態(tài)特點如表1 所示。

表1 參試茄子種質形態(tài)特點

1.2 方法

1.2.1 病樣采集與病原菌的分離 在南寧市良慶區(qū)那馬鎮(zhèn)茄子發(fā)病地塊采集發(fā)病枝條，干燥密封帶回實驗室進行分離。用75%乙醇擦拭感病枝條表面，0.1%的升汞浸泡消毒1 min 后無菌水沖洗3 遍，無菌紙吸干表面水分，用無菌鑷子取韌皮部下方的發(fā)病組織，接種于PDA 平板培養(yǎng)基上，于20 ℃黑暗條件下培養(yǎng)3～4 d。當白色菌絲出現(xiàn)后進行鏡檢，確定病原后將菌絲挑出轉接于PDA 平板培養(yǎng)基上，25 ℃下暗培養(yǎng)3～4 d，反復鏡檢與轉接直至培養(yǎng)基上病菌純化，用打孔器取培養(yǎng)基外圈制成直徑約7 mm 的菌碟，貼在茄子創(chuàng)傷莖部保濕固定進行致病性測定，顯癥后再次分離鑒定該病原菌與上輪分離有無差別。完成柯赫氏法則驗證后，將菌株命名為ESR001 并低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌rDNA-ITS 序列測定 參考周增強等（2012）的方法，采用簡化CTAB 法提取基因組DNA，利用真菌生物核糖體DNA 通用引物ITS1（5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇）和ITS4（5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇）進行PCR檢測，并將目標DNA 片段送至廣州擎科新業(yè)生物技術有限公司進行測序，測序結果在NCBI 上進行序列比對分析，確定該病原菌的分類地位。

1.2.3 茄子菌核病的田間接種鑒定 參考韓廣振等（2010）的方法對本試驗中茄子菌核病田間接種鑒定方法進行改進，茄子9 月播種，待幼苗長至四葉一心時移栽至大棚內，進入開花期時采用菌絲體進行田間活體莖接種。用刀片輕刮茄子莖部表皮制造長約0.5 cm 的傷口，用打孔器沿著菌落的外圍打孔制成直徑0.5 cm 的菌碟，將菌碟長有菌絲的一面貼于植株莖部刮破處，用脫脂棉浸無菌水包在菌碟的外面保濕，最外層用5 cm × 3 cm 的錫箔紙捆綁固定。每個品種接菌10 株，3 次重復，對照10 株（對照使用無菌PDA 培養(yǎng)基，其余與接菌處理相同），接種后噴霧保濕48 h，之后常規(guī)管理，每天噴灑無菌水1 次，保持濕潤。每天觀察病斑變化，并于接種病菌20 d 后，依據(jù)病情分級標準調查病情指數(shù)（disease severity index，DSI）進行抗性歸類。

1.2.4 茄子菌核病病級評價標準 參考韓廣振等（2010）對大豆菌核病的病級評價標準，根據(jù)菌絲體侵染茄子植株直徑的比例，將茄子菌核病發(fā)病級別分為0～5 個等級，評價標準參見表2 和圖1。茄子菌核病病情指數(shù)計算公式為：DSI=〔∑（各病級值×該病級株數(shù)）/（5 ×調查總株數(shù)）〕× 100。按照菌核病病情指數(shù)的大小，將抗性水平分為6 級：免疫（I）（病情指數(shù)=0，無侵染），高抗（HR）（0 ＜病情指數(shù)≤20），抗病（R）（20 ＜病情指數(shù)≤35），中抗（MR）（35 ＜病情指數(shù)≤50），感病（S）（50 ＜病情指數(shù)≤70），高感（HS）（70 ＜病情指數(shù)≤100）。

表2 茄子菌核病病情分級標準

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2016軟件進行計算，利用DPS 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 病原菌形態(tài)鑒定

菌株ESR001 在PDA 平板培養(yǎng)基上25 ℃條件下生長迅速，接種3～4 d 后菌落呈圓形并鋪滿整個平板，菌絲呈白色棉絮狀（圖2-A），再培養(yǎng)4～5 d 后，培養(yǎng)基邊緣棉絮狀菌絲聚集成團，先期白色，后漸變?yōu)樯詈稚罱K變?yōu)楹谏瑫r逐步變干變硬，表面粗糙，形成不規(guī)則狀的鼠糞狀菌核，直徑5～10 mm（圖2-B）。顯微鏡下觀察菌絲無色、透明、有隔膜（圖2-C）。

2.2 病原菌分子鑒定

對菌株ESR001 進行PCR 擴增獲得長度為524 bp 的片段，測序得到的ITS 序列在數(shù)據(jù)庫中進行序列分析，該病原菌菌株與已登記的Sclerotinia sclerotiorum真菌rDNA-ITS 序列相似，同源性達99.80%，與Sclerotinia trifoliorum同源性為98.81%，與Sclerotinia glacialis同源性為98.39%。ITS 序列提交至GenBank，登錄號為MN099 281.1，使用MEGA 6.0 軟件，選擇灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）作為外類群，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示該病原菌與已鑒定為Sclerotinia sclerotiorum的真菌聚類在一起（圖3）。經(jīng)形態(tài)學、分子生物學方法鑒定該病原菌為核盤菌〔Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary〕，引起茄子菌核病。

2.3 茄子種質菌核病抗性鑒定

對42 份茄子種質進行田間活體莖接種鑒定，接種10 d 后茄子枝條可見明顯病斑，隨時間推移病斑繼續(xù)外擴，接種20 d 后病斑停止擴展，統(tǒng)計病情指數(shù)，結果如表3 和表4 所示。不同茄子品種和種質類別的病情指數(shù)差異極顯著（P＜0.01），對菌核病的抗性水平亦不相同，其中，免疫材料6份，占鑒定種質的14.29%，均為茄子野生種及其雜種后代；高抗材料1 份和抗病材料3 份，分別占鑒定種質的2.38%和7.14%，均為紅茄；中抗材料4 份，占鑒定種質的9.52%，均為初級栽培茄；感病材料10 份和高感材料18 份，分別占鑒定種質的23.81%和42.86%。

表4 42 份茄子種質的菌核病病情指數(shù)方差分析

對不同茄子種質類別的病情指數(shù)和抗病水平分析發(fā)現(xiàn)（表5），高級栽培茄的平均病情指數(shù)高達74.53，顯著高于其他種質類別，均為感病或者高感材料；其次為初級栽培茄，平均病情指數(shù)為49.07，無抗病或高抗材料，中抗材料4 份（編號D2、D11、D27、SHF），占該鑒定類別種質的80%，其余1 份材料表現(xiàn)為感病；紅茄的平均病情指數(shù)為36.78，高抗材料1 份（編號53），占該鑒定類別種質的16.67%，抗病材料3 份（編號137、166、Y11），占該鑒定類別種質的50.00%，其余2 份材料表現(xiàn)為感病；野生茄（編號S101、Y12、WCB）病情指數(shù)為0，抗病水平達免疫，占該類型種質的100.00%；同時鑒定發(fā)現(xiàn)，種間雜種53 × WCB 及以菌核病高感材料116、117 為母本，以免疫材料S101 為父本的遠緣雜種116 × S101、117 × S101 的病情指數(shù)均為0，對菌核病的抗性水平達到免疫，說明野生種攜帶的菌核病抗源可通過雜交轉育。

表5 茄子種質類別抗性統(tǒng)計分析

3 討論與結論

本試驗中茄子菌核病菌株ESR001 是從廣西越夏發(fā)病的茄子病株上分離純化獲得的，經(jīng)形態(tài)特征觀察初步認定為核盤菌。通過進一步對ITS 序列分析表明此菌株屬于核盤菌屬，與其他屬種存在顯著的遺傳差異，與Sclerotinia sclerotiorum的同源性達到99.80%，因此可以確定該病原菌為核盤菌〔Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary〕。由于菌核病對不同寄主的致病力和發(fā)病癥狀均有較大差異（Nahar et al.，2019），以及寄主的防御機制也不盡相同（Wang et al.，2019），本試驗對廣西茄子菌核病病原菌的鑒定將有助于該病原菌致病機理和防御機制研究工作的進一步開展和深入，可為茄子菌核病的防治研究提供依據(jù)。

菌核病抗性鑒定在大豆和油菜上有較多報道（冉毅 等，2007；韓廣振 等，2010；劉玲彥，2013；馬田田 等，2014；孫明明 等，2017；何烈干 等，2018），而國內外還沒有統(tǒng)一的茄子菌核病鑒定方法和評價標準，田間或溫室接種相關研究鮮見報道。結合茄子的植株特點，參考韓廣振等（2010）對大豆菌核病田間活體莖的接種鑒定方法，本試驗對茄子菌核病田間接種鑒定方法進行了改進。采用了菌絲體接種方式，且采用了保濕性好的錫箔紙將無菌濕潤脫脂棉和菌絲體緊密包裹固定在植株傷口處，保證了每個接種體侵染環(huán)境的相對一致，且每日噴灑無菌水，保持潮濕環(huán)境有利于菌絲體生長和侵染。該方法能較好地區(qū)分不同材料之間的抗性水平，可作為茄子菌核病抗性的有效鑒定方法。菌核病菌菌絲體的生長和侵染能力受環(huán)境溫度和濕度的影響較大（母紅巖，2017），因此可通過多年多點的重復接種鑒定或利用人工氣候室控制環(huán)境溫濕度提高鑒定的準確性。目前我國茄子栽培品種中抗病、高抗菌核病的材料甚少，也沒有明確的對照種質，因此還需要在茄子菌核病的鑒定方面進行深入研究。

核盤菌寄主范圍廣泛，傳播途徑及致病機理復雜（Melo et al.，2019），茄子抗病遺傳資源缺乏，導致茄子菌核病的研究進展緩慢。茄屬物種豐富，在東南亞、非洲、南美以及我國南方均有茄屬野生種 分 布（Tepe &Bohs，2011；Stern et al.，2013；Ranil et al.，2017；Aubriot et al.，2018），在自然選擇中形成與保留了許多栽培茄所不具備或人工選擇過程中已喪失的抗性基因，前人研究表明茄子野生種具有豐富的青枯病（劉富中 等，2005；李兆龍 等，2015）、黃萎病（王益奎 等，2011；馬艷，2016；吳麗艷 等，2017）等抗病基因資源，特別是水茄（S.torvum），已被研究證明是復合多個優(yōu)良基因的野生材料（王洋 等，2020），而尚未見有抗菌核病的相關報道。本試驗對42 份茄子種質資源的菌核病抗性鑒定統(tǒng)計結果顯示，國內收集的栽培茄中沒有抗菌核病材料，而茄子野生種（S.aethiopicum、S.torvum、S.sisymbriifolium、S.anguivi）具有菌核病抗源，東南亞收集的栽培茄中初級栽培茄（S.melongenasubsp.ovigerum）的菌核病抗性強于高級栽培茄，下一步可擴大該類資源的鑒定規(guī)模，以期篩選出親緣關系更接近國內栽培種的高抗資源。栽培茄與茄屬野生種雜交可以拓寬茄子遺傳基礎，同時也是轉育優(yōu)良基因的有效手段（曹必好 等，2009），茄子遠緣雜交存在生殖障礙，栽培茄（S.melongena）與野生種S.torvum的雜交表現(xiàn)為F1不育，且父母本花粉與雜交后代F1柱頭不親和（王益奎 等，2015），而刺天茄（S.anguivi）作為菌核病另一抗源材料可與紅茄（S.aethiopicum）雜交并產生對菌核病表現(xiàn)免疫的可育后代，有研究表明非洲紅茄（S.aethiopicum）與栽培茄的種間雜種可通過利用母本持續(xù)回交逐漸恢復育性（莊勇和王述彬，2011）。因此，可利用高抗紅茄作為育種橋梁，將野生種的抗病性導入到栽培茄中，得到抗病性好、商品性優(yōu)良的茄子品種。這為野生資源有利基因的轉育利用提供了可能途徑，可為防治茄子菌核病和抗病種質的選育提供參考。