流相二氧化氯處理對蘋果鏈格孢菌侵染的防治效果及貯藏品質的影響

閻一鳴，張鮮桃，賈曉昱，姜瑜倩，賈紅霞，李喜宏,*

（1.天津科技大學食品科學與工程學院，天津科技大學省部共建食品營養與安全國家重點實驗室，天津 300457；2.天津綠新低溫科技有限公司，天津 300457；3.天津利源捷能氣體設備股份有限公司，天津 300392）

蘋果，薔薇科蘋果屬植物，其所具備的高營養價值及商業價值使之成為人們日常生活中最為常見的水果之一。但是，在其采摘、運輸等過程中，不可避免地會受到不同種類的損傷，而破潰部位極易受到真菌病原體侵染，嚴重影響其食用價值、營養價值及商業價值。其中，由鏈格孢菌引起的爛果是蘋果果實重要的采后侵染性病害之一。目前，尚沒有抗爛果病的蘋果品種，因此所有的蘋果品種均易感染此病[1]。而當前防治該菌常用的化學藥劑有硫菌靈、苯菌靈、多菌靈、速克靈等[2]，雖然這些藥品均有較好的防治效果，但易殘留在果蔬表面，降低果蔬的食用安全性[3]。隨著我果對食品安全要求的提高，亟待尋找一種安全、無污染、低毒、低殘留的高效抑菌劑解決該困境。

二氧化氯是目前國際上公認的高效、廣譜、快速、安全、無污染的第4代滅菌消毒劑，現已在采后葡萄[4]、西蘭花[5]等果蔬中開展了保鮮及抑菌效果的研究。它對果蔬表面微生物的細胞壁有較強的吸附力和穿透力，透過細胞壁進入細胞后，一方面作用于含硫基的酶，另一方面氧化核酸（DNA/RNA），控制微生物中蛋白質的合成，使其失活或改性，從而阻止微生物的合成代謝。此外，二氧化氯利用其強氧化性，可以破壞真菌細胞的細胞壁，改變細胞滲透壓，使細胞內含物（含氮有機化合物、ATP）泄露，并改變真菌孢子的形狀，從而滅活真菌[6]。前人報道稱氣態抗菌劑比液態更有效[7]，但是制造氣態二氧化氯的化學方法存在H2SO4消耗量大、副產物Na2SO4不易回收的難題[8]；其電解法所需設備復雜、生產成本高、產氣量不穩定、故障率高、耗電量大等問題均影響了氣態二氧化氯的推廣和應用[9]。而霧化可以使液體以細霧的形式在空氣中擴散，其滲透能力增強，并且比液態抗菌劑更有效，因此，近年來霧化抗菌劑在改善新鮮農產品的安全性方面越來越受到重視[10]。

本研究依據“流水不腐”原理，采用流動微循環處理采后蘋果果實，以無菌水處理為對照，研究了80 mg·L-1和400 mg·L-1霧化二氧化氯對鏈格孢菌的抑制效果，以及對經鏈格孢菌侵染的蘋果的品質影響。通過觀察、比較試驗組和對照組的蘋果果實在貯藏期間的病斑擴展、果實品質、防御性物質含量及防御性酶活性的差異，為采后果實保鮮提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

富士蘋果購買于天津市濱海新區某水果批發市場，挑選成熟度、大小、色澤一致且無機械傷及病蟲害侵染的果實，運回實驗室后，立即用2%二氧化氯溶液消毒2 min，再用無菌去離子水沖洗2次，而后將其置于無菌操作臺中風干。處理好的蘋果將用于進一步接種試驗。

純種鏈格孢霉菌購買于中國典型培養物保藏中心，菌種保藏號CCTCCAF 207029，于4℃下儲存。

1.1.2 儀器與設備

SC250-M040型超聲波霧化器：佛山市順德區巨科電器有限公司；T6型紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；TGL-16型高速冷凍離心機：四川蜀科儀器有限公司；AUY120型電子分析天平：深圳力達信儀器有限公司；HH-6型數顯恒溫水浴鍋：邦西儀器科技（上海）有限公司；GY-3型硬度計：浙江托普儀器有限公司；PAL-1型手持糖度儀：大連楓洲科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗方案設計

用接種環輕輕刮擦含有活化后的鏈格孢霉菌的培養基表面，而后將其轉移至無菌生理鹽水中，制成分生孢子懸浮液。在每個蘋果果實的赤道部位用無菌水洗過的釘子刺傷，形成深3 mm、寬3 mm的創面，并將20μL分生孢子懸浮液注射到每個蘋果果實的受傷部位，待菌液吸收后，獲得接種后的果實。

根據預試驗的結果，制備80 mg·L-1和400 mg·L-1二氧化氯溶液用于試驗組處理，對照組用無菌水處理。將上述溶液依次放置在超聲波霧化器中，霧化后通過長度為64 cm的管子（直徑為2.54 cm）引入流相防腐裝置中，隨著1.5 m·s-1無菌風在密封裝置中循環流動。蘋果果實接種部位與循環風逆向放置，保證果實與霧化劑均勻接觸10 min后取出，用0.04 mm厚的聚乙烯袋進行包裝，而后在20℃條件下進行貯藏。分別在試驗的0、5、10、15、20、25、30 d對試驗組和對照組的蘋果果實進行取樣，測定各項生理指標。每種處理、每個指標均設置3次重復。

1.2.2 測定項目與方法

1.2.2.1 病斑直徑

采用十字交叉法[11]測量。

1.2.2.2 硬度

手持配有直徑3.5 mm的圓形柱塞的水果硬度儀，在靠近接種處的赤道位置測定果肉硬度，單位以kg·cm-2表示。每種處理選取3個蘋果果實進行測定，每個蘋果設2次平行。

1.2.2.3 可溶性固形物（TSS）含量

每種處理取3個蘋果果實，每個果實取多個部位的果肉，將其置于研缽中進行充分研磨，用4層紗布過濾，勻漿滴在手持糖度儀檢測鏡上，記錄數據，單位以%表示。

1.2.2.4 可滴定酸（TA）含量

采用氫氧化鈉滴定法，具體參照曹建康等[12]的方法，并稍作修改。稱取10 g蘋果果肉，于研缽中磨至勻漿，轉移至100 mL容量瓶中，并用蒸餾水定容至刻度，上下顛倒搖勻，靜置30 min備用。取20.00 mL濾液，轉入到三角瓶中，加入2～3滴1%酚酞，用已標定的標準濃度氫氧化鈉滴定至溶液初顯粉色并在30 s內不褪色時為滴定終點（pH=8.1～8.3），記錄氫氧化鈉溶液用量，重復3次。

1.2.2.5 丙二醛（MDA）含量

采用硫代巴比妥酸比色法測定，具體參考Zhang等[13]的方法，單位以 μmol·g-1表示。

1.2.2.6 總酚含量

采用Folin-Ciocalteu比色法，具體參照Liu等[14]的方法，單位以mg·g-1表示。

1.2.2.7 過氧化物酶活性

采用愈創木酚法，具體參考曹建康等[12]的方法，單位以U·g-·1min-1表示。

1.2.2.8 多酚氧化酶活性

參考白鴿等[15]的方法，單位以U·g-1·min-1表示。

1.2.2.9 苯丙氨酸解氨酶活性

參考吳芳芳等[16]的方法測定，單位以U·g-1·h-1表示。

1.2.3 數據處理

所有試驗數據均至少3個重復，并使用完全隨機設計。數據表示為平均值±標準誤差。使用統計軟件Origin 8.0進行統計分析。采用SPSS13.0進行單向方差分析試驗與對照之間的顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 霧化二氧化氯處理對蘋果鏈格孢菌侵染病斑直徑的抑制效果

由圖1可以看出，與對照組霧化無菌水處理蘋果果實相比，兩種濃度的霧化二氧化氯均對鏈格孢菌侵染的蘋果果實有抑制作用。隨著貯藏時間的延長，試驗組與對照組病斑直徑變化逐漸明顯。貯藏至15 d時，與對照組相比，80 mg·L-1和400 mg·L-1霧化二氧化氯處理的蘋果果實病斑直徑分別減小了20.56%和8.19%。由此表明，霧化二氧化氯能夠有效抑制經鏈格孢菌侵染的蘋果果實的病斑擴展，其中80 mg·L-1二氧化氯處理組效果更好。

圖1 霧化二氧化氯處理對蘋果鏈格孢菌侵染病斑直徑的影響Fig.1 Effectsof atomized chlorinedioxidetreatmentson lesion diameters of apples infected with Alternaria alternata

2.2 霧化二氧化氯處理對蘋果果實品質的影響

2.2.1 霧化二氧化氯處理對蘋果果實硬度的影響

硬度可用來判斷果實的軟化程度。如圖2所示，在貯藏0～10 d內，蘋果果實的硬度呈逐漸上升趨勢，且試驗組和對照組均在第10天達到峰值，此時，經80 mg·L-1霧化二氧化氯處理的果實硬度最大，為13.1 kg·cm-2，之后3組果實硬度均逐漸下降。其中，經霧化無菌水處理的對照組果實硬度下降最快，貯藏第30天降為6.45 kg·cm-2。這可能是由于鏈格孢菌能夠分泌纖維素酶和果膠酶等細胞壁降解酶以破壞宿主的細胞壁，進而加速果實硬度的下降；而霧化二氧化氯能夠抑制微生物蛋白質的合成，降低微生物代謝活性，有助于果實硬度的保持[2]。對比兩個試驗組，經80 mg·L-1霧化二氧化氯處理的果實硬度下降速率更緩，因此延緩硬度下降速率的效果優于霧化400 mg·L-1二氧化氯處理。

圖2 霧化二氧化氯處理對蘋果果實硬度的影響Fig.2 Effectsof atomized chlorine dioxidetreatmentson firmnessin apples fruits

2.2.2 霧化二氧化氯處理對蘋果果實可溶性固形物含量的影響

可溶性固形物是指液體或流體食品中所有溶解于水的化合物的總稱，包括糖、酸、維生素、礦物質等[17]，其含量變化可以反映出果實的成熟度、品質波動及代謝活動[18]。如圖3所示，在貯藏30 d內果實中可溶性固形物含量波動較大，試驗組和對照組的可溶性固形物含量均呈現先上升后下降的趨勢，且均在第10天達到峰值。這可能是由于貯藏前期果實中的淀粉逐漸轉化為可溶性糖，而后期可溶性糖和有機酸又作為果實呼吸的底物被分解所導致的。貯藏10～30 d，對照組果實的可溶性固形物下降速率大于試驗組，因此霧化二氧化氯處理能夠有效延緩采后蘋果果實品質的下降速率，且80 mg·L-1霧化二氧化氯處理的效果優于400 mg·L-1處理。

圖3 霧化二氧化氯處理對蘋果果實可溶性固形物含量的影響Fig.3 Effectsof atomized chlorine dioxidetreatmets on solublesolid contents in applesfruits

2.2.3 霧化二氧化氯處理對蘋果果實可滴定酸含量的影響

可滴定酸含量能夠直接反映果實的品質和成熟度，是品質的重要評價指標之一[19]。由圖4可以看出，經鏈格孢菌侵染后，采用流相技術防腐保鮮的果實，其可滴定酸含量均在第5天達到峰值，其中經霧化二氧化氯處理的可滴定酸含量為0.251%～0.255%，而對照組可滴定酸含量為0.233%，此后3組果實可滴定酸含量在后期貯藏過程中不斷降低，且在第5～10天下降速度較快，貯藏10 d之后下降速度減緩。貯藏第20天，對照組可滴定酸含量降至0.164%，而80 mg·L-1霧化二氧化氯和400 mg·L-1霧化二氧化氯處理組的可滴定含量僅分別降至0.177%和0.162%。貯藏后期，試驗組的可滴定酸含量下降速率大于對照組，這可能是因外界脅迫而造成的代謝加快引起。

圖4 霧化二氧化氯處理對蘋果果實可滴定酸含量的影響Fig.4 Effectsof atomized chlorine dioxidetreatmentson titratable acidity contentsin applesfruits

2.2.4 霧化二氧化氯處理對蘋果果實丙二醛含量的影響

MDA是細胞膜脂過氧化作用的產物之一，其產生數量的多少可代表膜脂過氧化的程度，能夠直接反映細胞膜的受損程度，間接反映植物組織的抗氧化能力。同時，丙二醛的產生會加劇細胞膜的受損，致使細胞內的各種小分子物質外漏，進而改變細胞內外的滲透壓，嚴重時因內外滲透壓的差別過大而使細胞破裂[20]。由圖5可以看出，試驗組和對照組的蘋果在貯藏30 d內，MDA含量均呈現逐漸上升趨勢，且與對照組相比，二氧化氯處理能夠降低MDA產生的速率。這可能是由于鏈格孢菌分泌的毒素會破壞宿主細胞膜的通透性，使得胞內電解質外滲[2]，而二氧化氯能夠降低微生物活性，延緩MDA的產生，抑制細胞膜結構的損傷，從而有效延緩采后蘋果果實的衰老。

圖5 霧化二氧化氯處理對蘋果果實丙二醛含量的影響Fig.5 Effects of atomized chlorinedioxide treatmentson MDAcontentsin applesfruits

2.3 霧化二氧化氯處理對蘋果果實中防御物質含量及防御酶活性的影響

2.3.1 霧化二氧化氯處理對蘋果果實總酚含量的影響

酚類化合物是植物體內重要的次生代謝物質，植物受到病原菌侵染后，酚類物質會發生明顯變化[21]。由圖6可知，貯藏0～20 d內，3種處理的果實總酚含量呈波動式上升。但隨著時間的推移，不同處理組的果實總酚含量波動趨勢有所不同。20～30 d貯藏過程中，80 mg·L-1霧化二氧化氯處理組的總酚含量保持波動上升的趨勢，且在第30天時總酚含量達到815.53 mg·g-1，而400 mg·L-1霧化二氧化氯處理組和對照組總酚含量在貯藏后期逐漸降低。

2.3.2 霧化二氧化氯處理對蘋果果實過氧化物酶活性的影響

植物在逆境初期先建立起抗氧化酶的第一道防線對抗自由基的攻擊。其中，過氧化物酶（POD）是植物在逆境條件下酶促防御系統的關鍵酶之一[22]。由圖7可知，3種處理的POD活性均在貯藏的第15天發生降低。此時，80 mg·L-1和400 mg·L-1霧化二氧化氯處理組POD活性降至2.75 U·g-·1min-1和1.77 U·g-·1min-1，分別是對照組的2.33倍和1.5倍。且在整個貯藏過程中，對照組的POD活性在貯藏期內始終處于較低水平，而經霧化二氧化氯處理的蘋果果實的POD活性呈現波動上升的趨勢。貯藏第30天，80 mg·L-1和400 mg·L-1霧化二氧化氯處理組果實POD活性高達4.50 U·g-1·min-1和3.62 U·g-·1min-1，分別是對照組的2.08和1.68倍。由此表明，流相二氧化氯處理有助于提高果實POD活性。

圖7 霧化二氧化氯處理對蘋果果實過氧化物酶活性的影響Fig.7 Effectsof atomized chlorine dioxide treatmentson POD activitiesin applesfruits

2.3.3 霧化二氧化氯處理對蘋果果實多酚氧化酶活性的影響

多酚氧化酶（PPO）是植物體內眾多防御物質中的重要種類之一，屬于植物抗營養型防御物質[23]。由圖8可知，在整個貯藏過程中，PPO活性與其他抗氧化酶活性變化趨勢不同，其活性呈現先下降再升高而后又下降的趨勢。貯藏第25天，80 mg·L-1霧化二氧化氯處理組果實PPO活性高達1.71 U·g-1·min-1，與400 mg·L-1霧化二氧化氯處理組（0.76 U·g-1·min-1）和對照組（0.64 U·g-·1min-）1之間存在顯著差異（P＜0.05）。由此表明，80 mg·L-1霧化二氧化氯處理采后蘋果果實可以顯著提高PPO活性，并有助于抵御鏈格孢菌的侵染。

圖8 霧化二氧化氯處理對蘋果果實過氧化物酶活性的影響Fig.8 Effectsof atomized chlorinedioxidetreatmentson PPO activities in apples fruits

2.3.4 霧化二氧化氯處理對蘋果果實苯丙氨酸解氨酶活性的影響

苯丙氨酸解氨酶（PAL）是植物苯丙烷類代謝途徑的關鍵酶之一，病原菌侵染和病原菌毒素處理都能誘導苯丙氨酸解氨酶活性增強，且酶活增強與抗病性呈正相關[24]。如圖9所示，貯藏期內的PAL活性呈現波動上升的趨勢。貯藏第30天時，3種處理的PAL活性均達到最大值，80 mg·L-1霧化二氧化氯處理組PAL活性高達8.51 U·g-1·h-1，400 mg·L-1霧化二氧化氯處理組酶活性為7.25 U·g-1·h-1，分別為對照組的1.25倍和1.07倍。由此說明，流相二氧化氯處理能夠提高蘋果果實PAL活性，有助于果實防御機制的啟動。

圖9 霧化二氧化氯處理對蘋果果實苯丙氨酸解氨酶活性的影響Fig.9 Effects of atomized chlorine dioxide treatments on PAL activitiesin apples fruits

3 結論與討論

蘋果爛果病通常由鏈格孢菌侵染所引起，主要發生在采后貯運階段。傳統化學藥劑雖然抑菌、保鮮效果好，但是易殘留在果實表面，造成其食用安全性降低，進而亟需尋找一種濃度低、效果好的蘋果防腐保鮮劑。本試驗依據“流水不腐”的原理，在密閉空間內采用流相，即霧化不同濃度二氧化氯處理經鏈格孢菌侵染的蘋果果實，觀察病斑擴展情況、蘋果品質變化及防御性物質、防御性酶活性的變化情況。Jiang等[10]以圣女果為試驗材料，研究不同濃度霧化過氧乙酸、二氧化氯及乳酸、醋酸和乙酰丙酸的混合物滅活沙門氏菌的效果，并認為密閉環境中霧化抗菌劑可以作為圣女果沙門氏菌滅活的新方法。

本試驗結果表明，與采用霧化無菌水處理的對照組相比，低濃度和高濃度的霧化二氧化氯處理均能在不同程度上起到抑制鏈格孢菌侵染及維持蘋果品質的效果。一方面能夠抑制果實病斑直徑增大，起到抑菌效果；另一方面能夠延緩果實硬度下降速率，可溶性固形物和可滴定酸含量的降低及丙二醛含量的上升；最后一方面提高果實中防御性物質總酚含量和過氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶等防御性酶活性，進而有助于維持貯藏過程中的蘋果品質。其中，80mg·L-1霧化二氧化氯處理組的效果優于400 mg·L-1霧化二氧化氯處理，這可能是由于二氧化氯濃度過高，使得果實細胞膜透性增加，細胞質外流[25]，加速果實硬度下降速度，從而不利于蘋果品質的保持和長期貯藏。此前，余璐璐等[26]用梯度濃度二氧化氯處理草莓果實，研究結果表明：高濃度二氧化氯在抑菌的同時會對果實造成損傷。綜上所述，霧化二氧化氯對蘋果或其他水果的品質影響，仍需要通過對防御性酶活性的基因表達情況進一步研究確認。流相防腐技術可以作為今后果蔬防腐的研究方向，為尋求高效、低污染的防腐保鮮技術提供新思路。