高效液相色譜法測定羧甲基殼聚糖/水楊酸處理的葡萄柚果實中水楊酸含量

李文清，孔珊珊，馬電通，朱紹志，李賢忠，鄧 佳,2,*

（1.西南林業大學林學院，云南 昆明 650224；2.西南山地森林資源保育利用省部共建教育部重點實驗室，云南 昆明 650224）

葡萄柚營養價值高，味酸甜略帶苦味，主要用以鮮食、榨汁等，深受消費者喜愛，但葡萄柚鮮果采后易受青、綠霉病菌侵染而嚴重腐爛[1]。羧甲基殼聚糖（Carboxymethyl Chitosan，CMC）是殼聚糖（Chitosan，CTS）的一種衍生物，相比殼聚糖，羧甲基殼聚糖具有較好的水溶性、成膜性、吸濕保濕性等優良特性[2]。鄧雨艷等[3]研究表明，殼聚糖可以誘導臍橙果實水楊酸的升高。水楊酸（Salicylic Acid，SA）是一種簡單酚類化合物，是近年來研究較熱的新型植物激素。大量研究表明，水楊酸作為一種內源信號分子參與植物體抗性反應，其含量水平與植物抗病性表現出一定的相關性，可以促使植物產生系統獲得抗性[4]。張玉[5]研究發現，乙酰水楊酸（ASA）處理可以顯著提高獼猴桃果實組織中水楊酸水平，并通過水楊酸的生理效應延緩果實的成熟衰老。也有研究表明，1.5%殼聚糖+1.5 mmol/L水楊酸處理在延緩黑莓果實衰老和保持果實品質方面非常有效[6]。高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC） 因具有重現性好、分辨率和靈敏度高、分析速度快等特點，目前被廣泛用于食品[7]、藥品[8-10]和植物組織[11-14]中水楊酸的檢測。水楊酸屬于酚酸類，且植物組織內源水楊酸水平很低，檢測難度較大，因此，許多研究者探究了水楊酸在果實內的高效液相色譜檢測方法，并對果實內源水楊酸提取方法和檢測條件進行了改進和優化調整，簡化了提取步驟，提高了方法回收率。

目前，有關柑橘類果實水楊酸的提取測定已有一些報道[15-16]，但原有提取方法對葡萄柚果實水楊酸的分離及測定效果并不理想，故本文以葡萄柚果實為研究對象，對其果皮水楊酸提取的不同方法、檢測條件進行比較、優化，以期獲得較佳的葡萄柚果皮水楊酸的提取及高效液相色譜測定的方法，并測定分析羧甲基殼聚糖、水楊酸單獨/復合處理葡萄柚果皮中游離態水楊酸和結合態水楊酸含量變化情況，以期為合理、安全地利用外源羧甲基殼聚糖、水楊酸誘導提高果實抗病性及安全生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

“里約紅”葡萄柚，于2018年9月采自昆明商業化種植園，選取成熟度一致，無蟲害、無機械損傷的果實，包裝于紙箱，24 h之內運回西南林業大學教育部重點實驗室。

水楊酸（標準品）、乙腈（色譜級）、甲醇（色譜級），均為美國Sigma公司產品；冰乙酸（0.1 mol/L，pH 5.5）、三氯乙酸、乙酸鈉（0.2 mol/L，pH 5.5）、乙酸乙酯、環己烷等試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

Aligent 1260色譜儀，Eclipse XDB-C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Agilent G1316A紫外檢測器，均為安捷倫科技有限公司產品；AR224CN電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；SK5200HP型臺式超聲波清洗器，上海科導超聲儀器有限公司；MIKRO 220R型臺式高速冷凍離心機，廣州市華粵行儀器有限公司；0.22μm微孔濾膜針式過濾器，江蘇綠盟科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 水楊酸色譜條件的篩選

1.2.1.1 流動相的篩選

根據前人摸索的HPLC條件[11,17-19]，流動相為色譜級乙腈和乙酸25∶75（V/V），色譜級甲醇和乙酸50∶50、60∶40（V/V），色譜級甲醇和乙酸鈉混合液，其比例分別為50∶50、60∶40、70∶30（V/V），控制流速為1 mL/min，進樣量為10μL，分別用不同比例的流動相定容水楊酸標準品和提取物進行HPLC檢測。

1.2.1.2 流速和進樣量的篩選

將標準溶液稀釋至適宜濃度樣品，分別在流速為0.5、0.8、1.0 mL/min條件下觀察色譜峰的分離度，從而確定測定水楊酸的適宜流速；進樣量分別為5、10、20μL，確定測定水楊酸的適宜進樣量。

1.2.1.3 精密度及線性關系試驗

用天平精密稱取50.00 mg水楊酸標準品，置于50mL量瓶中，用60%甲醇+40%乙酸鈉溶液（0.2mol/L，pH 5.5）的混合液配制濃度為1.0 mg/mL水楊酸標準溶液，取標準溶液在最佳色譜條件下進行測定，連續重復進樣6次，對照水楊酸的峰面積，記錄其峰面積的數值，計算相對標準偏差。再將標準液稀釋成0、3.91、7.81、15.63、31.25、125、500μg/mL的標準溶液，將不同濃度的標準溶液用HPLC測定，以水楊酸標準溶液的質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，制作標準曲線。

1.2.2 提取方法的確定

試驗比較了3種水楊酸提取方法。方法1：參考張玉等[20]的方法，進行三氯乙酸/乙醚萃取；方法2：參考鄧文紅等[11]、王倩倩[18]的提取方法，進行三氯乙酸/三氯甲烷萃取；方法3：參考鮑峰偉等[12]的提取方法，進行乙酸乙酯/環己烷萃取。3種方法提取的葡萄柚果皮游離態水楊酸和結合態水楊酸，采用相同色譜條件測定，并對其譜圖進行對比分析。

1.2.3 材料處理

選擇大小均一、成熟度一致、無機械損害的葡萄柚果實，隨機分為4組，將其浸入2%（V/V）次氯酸鈉中1 min進行表面消毒，之后用自來水沖洗，在室溫下風干。羧甲基殼聚糖和水楊酸的濃度選取根據前人研究[21]及課題組前期的試驗效果確定。

試驗設置3個處理，CMC處理：1.5 g/L羧甲基殼聚糖溶液中浸泡3 min；SA處理：0.2 g/L水楊酸溶液中浸泡3 min；CMC+SA處理：先于0.2 g/L水楊酸溶液中浸泡3 min，再于1.5 g/L羧甲基殼聚糖溶液中浸泡3 min；以蒸餾水浸泡處理3 min的果實作為對照（CK）。浸泡結束后將樣品于通風室溫晾干，置于室溫（20±2）℃、相對濕度85%～90%的環境下貯藏。每個處理20個果實，于處理后7、14、21、28 d取樣進行水楊酸提取測定。

1.2.4 內源水楊酸提取及測定

樣品前處理參照張玉等[20]的方法并改進。經外源水楊酸處理后的葡萄柚果實，測定內源SA時，先用75%乙醇擦拭果實表面，再用蒸餾水沖洗果實表面，晾干，確保果實表面干凈無殘留。取10.0 g果皮充分研磨后，轉入50 mL離心管中，加4.0 mL 5%的三氯乙酸，加超純水至20.0 mL后再加入30.0 mL乙醚，充分搖勻，浸提12 h，于10 000 r/min下離心5.0 min，取出上部乙醚相，水相再經乙醚重復提取2次，合并乙醚相，真空旋轉蒸干后，加入1.0 mL流動相溶液將其溶解，置于Eppendorf管中保存，即為游離態水楊酸樣品。已提取游離態水楊酸樣品的剩余水相加等體積2 mmol/L的HCl，于80℃水浴中加熱1.0 h，冷卻后用乙醚提取3次，合并乙醚相，蒸干后加入1.0 mL流動相液溶解，置于Eppendorf管中保存，即為結合態水楊酸樣品。樣品經0.22μm微孔過濾器過濾后，采用試驗篩選出的最佳HPLC條件進行檢測。采用比較保留時間定性，外標工作曲線法定量。

1.2.5 數據處理

試驗數據整理及制圖均采用Excel 2019軟件；數據的方差分析（ANOVA）采用SPSS 23.0軟件，利用Duncan’s多重比較對數據的顯著性差異進行分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 最佳色譜條件的確定

對采用不同有機溶劑作為流動相的有機相下水楊酸標準品的色譜峰圖比較分析可知，甲醇和乙酸鈉作為有機相下水楊酸峰形沒有太大的差異，乙腈和乙酸、甲醇和乙酸用作有機相時出現雜質峰，不宜用作定量分析，相比之下，甲醇和乙酸鈉作為流動相所測定的水楊酸標準品的色譜峰圖更加理想，所以選擇甲醇和乙酸鈉作為流動相。如圖1所示，用甲醇和乙酸鈉作為流動相，對比分析可知，甲醇與乙酸鈉體積比60∶40時的保留時間更短，在1.588 min時出完整峰形，也無其他雜峰影響，確定甲醇和乙酸鈉體積比60∶40流動相下水楊酸的保留時間最短，分離效果達到最佳。

圖1 不同流動相的標準水楊酸樣品峰圖Fig.1 The peak maps of standard SAusing different mobile phases

如表1所示，通過對比出峰時間、峰形的分離度可知，在0.5、0.8、1.0 mL/min的流速下，標準水楊酸樣品都會出現雜峰。0.8和1.0 mL/min流速下，不同進樣量下標準水楊酸峰型變化相似，進樣量為20μL時，標準水楊酸出現雜峰。通過比較，流速為0.8 mL/min、進樣量為5μL時，標準水楊酸和樣品水楊酸的出峰時間一致，且此時峰的保留時間較其他條件更短，綜合分析得出最佳色譜條件為：以甲醇∶乙酸鈉（60∶40（V/V））為流動相，波長296nm，流速0.8mL/min，進樣量5μL。

表1 不同進樣量和流速下的水楊酸色譜效果Table 1 Determination effectsof SAunder different flowratesand injection volumes

2.2 精密度的確定及標準曲線的建立

通過計算得出同一水楊酸標準品的峰面積，結果見表2，得到水楊酸的相對標準偏差（RSD）為0.86%，表明儀器精密度良好，重現性好。按照選用方法在最佳測定條件下，測得水楊酸標準品的濃度x在3.91～500μg/mL范圍之內與峰面積呈良好的線性關系（圖2），回歸方程為y=10.454x-19.166，R2=0.999 8。

表2 水楊酸標準品的峰面積Table 2 The peak areasof salicylic acid standard sample

圖2 水楊酸標準曲線Fig.2 The standard curve of SA standard sample

2.3 樣品的分離及提取

應用HPLC檢測水楊酸時，因為并存的各類物質相互干擾，分離效果差，提取方法便成為了關鍵。分別采用3種方法進行水楊酸提取，并對樣品進行測定，樣品圖譜如圖3所示。采用方法1取（三氯乙酸/乙醚）進行果皮水楊酸提，樣品中水楊酸保留時間與標準品保留時間均為1.6 min，雜質少，目標峰分離良好（圖3A）；采用方法2（三氯乙酸/三氯甲烷）進行水楊酸提取，樣品的雜質峰干擾較明顯，目標峰與雜質峰未完全分離（圖3B）；采用方法3（乙酸乙酯/環己烷）進行水楊酸提取，在樣品內測不到相應保留時間內的目標峰，雜質峰對目標峰影響較大（圖3C）。對比分析3種提取方法下的水楊酸峰圖，發現方法1提取效果較其他兩種方法好，表明采用三氯乙酸/乙醚提取葡萄柚果皮水楊酸，并在最佳HPLC檢測條件下葡萄柚水楊酸出峰效果較好。

圖3 不同提取溶劑下葡萄柚果皮中的水楊酸峰圖（三氯乙酸/乙醚(A)、三氯乙酸/三氯甲烷（B）、乙酸乙酯/環己烷（C））Fig.3 The peak mapsof SA in grapefruit peels under different extraction solventsincluding trichloroacetic acid/diethyl ether(A),trichloroacetic acid/trichloromethane(B)and ethyl acetate/cyclohexane(C)

2.4 羧甲基殼聚糖/水楊酸單獨及復合處理下葡萄柚果皮中的水楊酸含量

如圖4A所示，隨貯藏時間的延長，對照組葡萄柚果皮內總水楊酸含量逐漸減少，羧甲基殼聚糖和水楊酸處理誘導果皮水楊酸含量增加，除貯藏7 d時SA處理與對照差異不顯著外，其他處理總水楊酸含量均顯著高于對照組（P＜0.05）。貯藏期間，除第28天外，羧甲基殼聚糖+水楊酸復合處理效果優于羧甲基殼聚糖單獨處理組。

由圖4B可見，經不同處理后的葡萄柚果皮游離態水楊酸含量總體呈“下降—上升—下降”的變化趨勢。貯藏過程中，羧甲基殼聚糖和水楊酸單獨、復合處理組游離態水楊酸含量顯著高于對照組（P＜0.05）。貯藏第21天，羧甲基殼聚糖、水楊酸單獨和復合處理的游離態水楊酸含量分別到達峰值45.55、44.1、47.6μg/g，分別高出對照組99.34%、93.00%和108.32%。貯藏后期（21～28 d），不同處理組間的游離態水楊酸含量差異不顯著。

圖4 羧甲基殼聚糖、水楊酸單獨及復合處理下葡萄柚果皮總水楊酸（A）、游離態水楊酸（B）、結合態水楊酸（C）含量Fig.4 Thecontentsof total salicylic acid(A),freesalicylic acid(B)and conjugation salicylic acid(C)fromgrapefruit peelswith CMC/SA singleor combined treatments

如圖4C所示，整個貯藏過程中，葡萄柚果皮結合態水楊酸含量呈先升高后降低的趨勢，除貯藏7 d時SA處理與對照差異不顯著外，羧甲基殼聚糖、水楊酸單獨和復合處理組結合態水楊酸含量顯著高于對照組（P＜0.05）。

3 討論

水楊酸作為近年來研究較熱的一種新型植物激素，對植物生長發育起到重要的調節作用，內源水楊酸含量與介導的調控機制直接相關。由于水楊酸在植物體內的特殊作用，所以研究水楊酸的提取測定具有很重要的理論價值。但水楊酸在植物組織內含量甚微，檢測難度大，檢測方法直接決定其分離效果。常用的測定方法中，高效液相色譜法是一種比較簡單、成本較低的方法，利用該法檢測水楊酸是一個研究熱點。

測定植物激素通常選擇甲醇、乙腈等作為有機相，但乙腈成本明顯高于甲醇，所以依據成本及分離效果標準，以甲醇為首選利于普及應用。本試驗結果表明，用甲醇作為有機相進行分析效果較好。選擇不同的流動相來進行分析，使用等度洗脫的方法進行色譜條件的摸索。乙酸屬于弱酸，利于改善拖尾現象，本試驗發現采用0.1 mol/L乙酸作為流動相時，雜質峰與目標峰未能很好分離，張玉瓊等[13]探究了不同pH條件下的乙酸對樣品分離度的影響，顯示當pH＜3.6時，易與樣品中雜質峰重疊，這與本研究的結果相似。本試驗還采用0.2 mol/L的乙酸鈉溶液，分別設定甲醇添加量為50%、60%和70%，結果表明V甲醇∶V乙酸鈉=60∶40時，水楊酸的分離效果最好，在1～2 min即可洗脫出來，在樣品中未與雜質峰重疊，而且拖尾不嚴重。在此基礎上，分別考察了流速為0.5、0.8、1.0 mL/min時的分離效果，并設置5、10、20μL的進樣量，結果表明流速為0.8 mL/min時比0.5 mL/min和1.0 mL/min檢測時間短，且目標峰形完整無其他雜峰影響，分離效果好。進樣量為5μL較進樣量為10μL和20μL的檢測時間縮短，拖尾不嚴重。利用上述篩選的最佳檢測條件對同一水楊酸標準溶液進行重復檢測，結果表明此方法有較高的可重復性。對水楊酸標準溶液進行逐級稀釋，得到水楊酸的回歸方程、相關系數和線性范圍，結果表明標準品濃度在3.91～500μg/mL范圍與峰面積的相關性良好。

本試驗參考了水楊酸提取的3種方法，對其提取條件進行對比，分別取三氯乙酸/乙醚、三氯乙酸/三氯甲烷、乙酸乙酯/環己烷作為萃取劑對葡萄柚果皮中的水楊酸進行提取，發現經三氯乙酸/乙醚提取的水楊酸分離度較高，且水楊酸的目標峰峰形良好，其他兩種方法水楊酸雜質峰未能與目標峰很好分離。在已篩選的色譜條件下，對葡萄柚果皮進行檢測，樣品中的水楊酸幾乎沒有雜質峰，目標峰對稱性良好，分析時間也較短。

水楊酸在植物體內通常以游離態和結合態兩種形式存在，當游離態水楊酸含量達到閾值時，則會轉換為結合態水楊酸[16]。王引[22]在對紐荷爾臍橙抵御潰瘍病的研究中發現，結合態水楊酸是防御反應的主要形式，這期間可能存在某種轉化機制促使新合成的水楊酸向結合態轉變。不同植物組織中水楊酸含量不同，劉玉良等[23]測定了不同品種苜宿葉片總水楊酸最高含量為0.539 mg/g，鄧文紅等[11]測定了五角葉片中總水楊酸的含量為483.2μg/g，鮑峰偉等[12]測定了不同地區煙草中游離態的水楊酸最高含量為6.22μg/g，劉洪蛟等[17]測定了不同地區鏈莢豆中游離態水楊酸最高含量為57μg/g。王倩倩[18]測定了不同月份、不同樹莓品種以及樹莓植株不同發育部位的水楊酸含量，發現成熟期的果實中水楊酸含量較高，達1.39 mg/g。本試驗對羧甲基殼聚糖、水楊酸單獨及復合處理葡萄柚果皮的水楊酸進行提取，利用最佳色譜條件測定水楊酸含量，結果表明，葡萄柚果皮的游離態水楊酸含量范圍是18～47.6μg/g，結合態水楊酸含量范圍是68.05～273.85μg/g。與對照相比，羧甲基殼聚糖、水楊酸單獨及復合處理的果皮中游離態水楊酸和結合態水楊酸均呈上升的趨勢，羧甲基殼聚糖單獨和羧甲基殼聚糖與水楊酸復合處理誘導提高游離態水楊酸含量的效果比水楊酸獨處理更為明顯。羧甲基殼聚糖能夠在果實表面吸附形成一層薄膜，抑制果實水分散失，減少微生物的侵染[24]。研究表明SA可誘導植物產生系統獲得性抗性，提高相關病程蛋白的表達，從而增強植物的廣譜抗性[25]。羧甲基殼聚糖與水楊酸復合處理在果實表面形成完整而均勻的涂膜，可有效減少水分的揮發，有利于減緩葡萄柚果實的質量損失、抑制果實呼吸和減少微生物侵染，達到防腐的作用。綜合來看，二者復合處理對葡萄柚果皮內源水楊酸的誘導效果優于二者單獨處理。Shi等[26]采用10 g/L殼聚糖和2 nmol/L水楊酸處理葡萄柚果實后接種指狀青霉（Penicillium digitatum）病原菌，測定果皮內源水楊酸含量，結果表明，殼聚糖/水楊酸復合處理顯著誘導葡萄柚果皮內源水楊酸含量的升高，激活葡萄柚對綠霉病的抗性其效果優于單獨處理。本試驗與上述研究結果相似，表明本試驗選擇的處理原料羧甲基殼聚糖與殼聚糖都具有誘導果實水楊酸含量提高的作用，且羧甲基殼聚糖水溶性更好，便于生產操作，對羧甲基殼聚糖今后在采后果實保鮮應用具有指導意義。

4 結論

本試驗結果表明，葡萄柚果皮水楊酸最適提取溶劑為：三氯乙酸/乙醚，該條件下水楊酸分離度較高；HPLC測定最佳色譜條件為：流動相為甲醇和乙酸鈉（0.2 mol/L pH 5.5）（60∶40（V/V）），波長為296 nm，流速為0.8 mL/min，進樣量為5μL。該測定條件下，檢測精密度高，具有可重復性，RSD為0.86%，在3.91～500μg/mL范圍內有良好的線性關系，R2=0.999 8。利用最佳色譜條件測定對照組葡萄柚果皮水楊酸含量，發現隨貯藏時間的增長，其含量下降。經羧甲基殼聚糖與水楊酸單獨、復合處理的葡萄柚果皮水楊酸含量均顯著高于對照組含量，羧甲基殼聚糖與水楊酸復合處理能維持果皮水楊酸含量，其效果顯著優于二者單獨處理。