生鮮面優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離鑒定及致腐能力分析

溫青玉，張康逸,*，王燕芳，李耀強(qiáng)，李 芳

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南 鄭州 450002；2.河南省全谷物小麥制品加工國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；3.河南省全谷物鮮食加工工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450002；4.河南省安康食品科技研究院，河南 鄭州 450006；5.新鄉(xiāng)市星河生物科技有限公司，河南 新鄉(xiāng) 453600；6.白象食品股份有限公司，河南 鄭州 451162）

面條作為我國(guó)人們的傳統(tǒng)主食之一，有著悠久的歷史，且制作便捷，含有豐富的維生素、碳水化合物、蛋白質(zhì)和微量元素[1-2]。面條主要分為生鮮面、掛面和方便面等，其中生鮮面由于即做即食，口感筋道爽滑，頗受人們的喜愛，在我國(guó)占據(jù)很大的消費(fèi)市場(chǎng)。隨著我國(guó)食品工業(yè)的發(fā)展以及人們對(duì)食物越來越高的要求，對(duì)生鮮面的保水性、保存性和不宜腐敗性等提出了更高的要求。但由于生鮮面本身含水量高，容易因微生物的滋生而腐敗變質(zhì)，從而造成原料的大量浪費(fèi)[3-5]。因此，如何防止微生物對(duì)生鮮面品質(zhì)的損壞是提高生鮮面品質(zhì)和降低儲(chǔ)藏成本的重要研究方向之一。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)生鮮面中的腐敗菌有一定的研究報(bào)道。許玉慧等[6]在對(duì)即食濕面條腐敗微生物的分離中得出，導(dǎo)致濕面條腐敗變質(zhì)的微生物為細(xì)菌，其主要為枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。周其中[7]在生鮮濕面儲(chǔ)藏技術(shù)的研究中發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致腐敗的主要微生物為細(xì)菌和霉菌，另外也鑒定出了7個(gè)霉菌屬。黃斌等[8]對(duì)生鮮面進(jìn)行了危害分析和關(guān)鍵環(huán)節(jié)控制點(diǎn)的研究。劉增貴等[9]的研究表明，生鮮面條在30℃儲(chǔ)藏條件下，微生物迅速增殖，面條顏色逐漸變黃，得出微生物是造成面條劣變的重要因素。但目前對(duì)即食濕面條中腐敗微生物的相關(guān)研究報(bào)道相對(duì)較少，李昌文等[10]對(duì)即食濕面條的保鮮進(jìn)行了研究，但未對(duì)腐敗微生物進(jìn)行分離鑒定，而李運(yùn)通等[11]指出細(xì)菌是導(dǎo)致高水分面制品腐敗的主要微生物，會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜的生化反應(yīng)，從而導(dǎo)致面條品質(zhì)變質(zhì)。

本研究通過形態(tài)學(xué)觀察篩選生鮮面中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，再利用生理生化手段和16SrDNA序列分析法對(duì)生鮮面中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌進(jìn)行鑒定。同時(shí)，以感官評(píng)分、酸度、pH值和菌落總數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，綜合評(píng)價(jià)優(yōu)勢(shì)腐敗菌對(duì)不同儲(chǔ)藏時(shí)間生鮮面的致腐能力，為生鮮面的工業(yè)化生產(chǎn)和商品流通等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

小麥粉，金龍魚高筋麥芯小麥粉；食用鹽，河南省衛(wèi)群多品種鹽有限公司產(chǎn)品。

三氯甲烷、氯化鈉、革蘭氏染劑、氫氧化鈉、丙酮、30%過氧化氫溶液、V-P試劑盒、硝酸鹽、吲哚、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基，均為北京奧博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DNA提取試劑盒，西安擎科創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

YP-N型電子分析天平，上海精密儀器儀表有限公司；ST16R冷凍離心機(jī)，鄭州金友寧儀器有限公司；YXQ-LS-75SII立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱、SW-CJ-1BU超凈工作臺(tái)，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；PHS-25型pH計(jì)，上海雷磁儀器廠；WD-9413B型凝膠成像分析系統(tǒng)，北京六一生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生鮮面制作工藝

面粉、食鹽、水(質(zhì)量比100∶1∶39)→和面（慢速檔攪拌5 min，中速檔攪拌2 min）→熟化（室溫靜置15 min）→壓延（在壓輥間距為2、1.8、1.6和1.4 mm處各對(duì)折壓片5次，形成厚度為1.4 mm的面片）→切條→脫水（120℃烘干1 min）→裝袋

1.2.2 生鮮面的腐敗處理

將無菌生鮮面在25℃條件下進(jìn)行儲(chǔ)藏，直至腐敗變質(zhì)。

1.2.3 微生物計(jì)數(shù)

菌落總數(shù)測(cè)定：參照GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[12]規(guī)定的方法檢測(cè)；霉菌及酵母菌測(cè)定：參照GB4789.15—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》[13]規(guī)定的方法檢測(cè)。

1.2.4 生鮮面腐敗菌的分離純化

在無菌操作環(huán)境下，稱取已腐敗生鮮面樣品1 g，放入已滅過菌的研缽中，把生鮮面研碎，加入9 mL無菌水后再次進(jìn)行充分研磨，隨后取1 mL生鮮面的懸濁液進(jìn)行10倍系列梯度稀釋，選擇4個(gè)合適的稀釋度各吸取1 mL涂營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板，每個(gè)濃度下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，同時(shí)做好空白對(duì)照。涂布完成后將平板放入37℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h±2 h。待培養(yǎng)基上的細(xì)菌長(zhǎng)出，觀察培養(yǎng)基表面的菌落生長(zhǎng)狀況，確定優(yōu)勢(shì)腐敗菌，做好標(biāo)記。將標(biāo)記的菌落采用平板劃線法進(jìn)行分離純化，純化后的菌種低溫保藏待用。

1.2.5 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的鑒定

1.2.5.1 生理生化鑒定

參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[14]運(yùn)用菌落觀察等方法對(duì)試驗(yàn)中分離得到的菌株進(jìn)行初步鑒定；通過硝酸鹽還原、接觸酶、氧化酶、葡萄糖、甘露醇、木糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、V-P實(shí)驗(yàn)、明膠水解、淀粉水解、檸檬酸鹽利用、丙酸鹽利用、吲哚實(shí)驗(yàn)、耐鹽性實(shí)驗(yàn)和耐熱性等鑒定試驗(yàn)對(duì)分離的菌株進(jìn)行生理生化鑒定。

1.2.5.2 分子生物學(xué)鑒定

選取在適宜條件下培養(yǎng)了24 h左右的腐敗菌制成菌懸液，10 000 r/min離心10 min后棄去上清液，然后加入100μLddH2O制得模板DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括：模板DNA 2μL，引物27F 1μL，引物1541R 1μL，TaqPCR Master Mix（2×）25μL，ddH2O補(bǔ)至50μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性60 s，58℃復(fù)性60 s，72℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，隨后將擴(kuò)增產(chǎn)物送至西安擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，并登錄NCBI網(wǎng)站，與數(shù)據(jù)庫已知序列進(jìn)行比對(duì)，獲得相似性較高的菌株序列，使用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 生鮮面腐敗菌的致腐能力測(cè)定

1.2.6.1 處理方法

生鮮面經(jīng)包裝密封后紫外殺菌，得到無菌生鮮面。首先，將分離出的幾種供試優(yōu)勢(shì)菌分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，然后放入生化培養(yǎng)箱中于37℃下培養(yǎng)48 h，在無菌操作下用接種環(huán)分別挑取一定量培養(yǎng)好的菌株加入225 mL的無菌水中，充分混均，得到供試菌株菌懸液。然后將無菌生鮮面置于供試菌株菌懸液中浸泡30 s后拿出，用無菌包裝密封袋包裝后即為接種處理過的生鮮面，同時(shí)以無菌水代替供試菌株菌懸液按上述方式處理生鮮面作為空白對(duì)照（CK）。最后，將所有處理過的生鮮面樣品放入恒溫箱中25℃密封保存。每隔6 h定時(shí)取樣，對(duì)采集的樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，測(cè)定酸度、pH值和菌落總數(shù)，以評(píng)價(jià)幾種不同的菌株對(duì)生鮮面的致腐能力。

1.2.6.2 生鮮面的感官評(píng)價(jià)

根據(jù)任順成等[15]和張婉[16]的面條感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，由感官評(píng)價(jià)小組（5位經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的人員組成）對(duì)生鮮面的色澤、質(zhì)地、氣味、是否酸敗等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。感官評(píng)價(jià)采用10分制，當(dāng)評(píng)分低于5分（包括5分）時(shí)，生鮮面若出現(xiàn)酸味或霉變，即不能食用。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)詳見表1。

表1 生鮮面感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standardsof fresh noodles

1.2.6.3 生鮮面酸度的測(cè)定

參照GB 5009.239—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品酸度的測(cè)定》[17]規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6.4 生鮮面pH值的測(cè)定

參照GB5009.237—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測(cè)定》[18]規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6.5 生鮮面菌落總數(shù)測(cè)定

參照“1.2.3微生物計(jì)數(shù)法”進(jìn)行測(cè)定。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用3次平行試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用Origin 8.0軟件繪制數(shù)據(jù)圖。使用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 生鮮面微生物計(jì)數(shù)

將腐敗的面條分別接種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后，各培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況如表2所示。

表2 培養(yǎng)基中微生物的生長(zhǎng)情況Table 2 Growth states of microorganisms in media

由表2可知，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出較多的微生物，大大超過了NY/T 1512—2007《綠色食品 生面食、米粉制品》[19]中生面食菌落總數(shù)≤3×105CFU/g的要求。在主要用于培養(yǎng)霉菌和酵母菌的孟加拉紅培養(yǎng)基上幾乎沒有微生物。由此可知，導(dǎo)致生鮮面腐敗的優(yōu)勢(shì)腐敗微生物主要是細(xì)菌。

2.2 生鮮面優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離和篩選

2.2.1 腐敗菌菌落特征及比例

圖1為1、2和3號(hào)菌的菌落特征圖，表3為各種腐敗菌菌落的特征及比例。由表3可知，1號(hào)菌在培養(yǎng)基中的比例為39.25%，2號(hào)菌為30.45%，3號(hào)菌為21.34%，3株菌占所有腐敗菌的91.04%，表明這3株菌為生鮮面中主要的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。

表3 各種腐敗菌菌落特征及比例Table 3 Characteristics and proportionsof variousspoilage bacteria colonies

圖1 3種腐敗菌菌落特征圖Fig.1 The colony characteristics of three dominant spoilagebacteria

標(biāo)記1號(hào)菌為DX，2號(hào)菌為DY，3號(hào)菌為DZ，3株優(yōu)勢(shì)腐敗菌的生理生化特征如表4所示，由表4結(jié)果與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[14]初步對(duì)比可知，DX為枯草芽孢桿菌，DY為地衣芽孢桿菌，DZ為蠟狀芽孢桿菌。

表4 3株優(yōu)勢(shì)腐敗菌的生理生化特征Table 4 Physiological and biochemical characteristics of three dominant spoilage bacteria

2.2.2 16 SrDNA序列測(cè)定

將分離得到的3株優(yōu)勢(shì)菌DX、DY和DZ進(jìn)行16SrDNA測(cè)序鑒定。以3株優(yōu)勢(shì)腐敗菌株的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并做凝膠電泳檢測(cè)。

3株優(yōu)勢(shì)菌株16SrDNA的PCR擴(kuò)增電泳圖譜如圖2所示。由圖2可見，擴(kuò)增產(chǎn)物在1 500 bp附近可見清晰明亮條帶。

圖2 3株優(yōu)勢(shì)菌株16SrDNA的PCR擴(kuò)增電泳圖譜Fig.2 16SrDNA PCRamplification electrophoresis pattern of three dominant strains

3株優(yōu)勢(shì)菌株的16SrDNA序列同源性系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。由圖3可知，所有序列與已知序列的同源性均在97%以上，說明鑒定結(jié)果可靠。經(jīng)分子鑒定后，3株菌株分別為：DX為枯草芽孢桿菌，DY為地衣芽孢桿菌，DZ為蠟狀芽孢桿菌。

圖3 3株優(yōu)勢(shì)菌株16SrDNA序列同源性系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree of three dominant strainsbased on 16SrDNA sequence homology

2.3 優(yōu)勢(shì)致腐菌對(duì)生鮮面品質(zhì)的影響

2.3.1 感官評(píng)分

感官評(píng)價(jià)法目前是食品品質(zhì)評(píng)價(jià)的主要方法[20-21]。在25℃儲(chǔ)藏條件下接種腐敗菌的生鮮面感官評(píng)分的變化趨勢(shì)如圖4所示。由圖4可知，在儲(chǔ)藏期間，感官評(píng)分起始為9.10分，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，評(píng)分總體都呈下降趨勢(shì)，在儲(chǔ)藏12 h后生鮮面外觀明顯變暗，質(zhì)地發(fā)黏，伴隨有腐爛變質(zhì)的氣味，在儲(chǔ)藏30 h時(shí)感官評(píng)分達(dá)到最低，且不同微生物對(duì)生鮮面感官評(píng)價(jià)的影響程度不同。同時(shí)，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，感官評(píng)價(jià)下降的程度越來越明顯，其中接種DX的生鮮面的變質(zhì)程度最大，在儲(chǔ)藏30 h時(shí)感官評(píng)分達(dá)到最小值，即4.20分，其次是DZ和DY，其最小值分別為4.50分和5.10分，這與趙宏強(qiáng)等[22]研究的冷藏鱸魚片中優(yōu)勢(shì)腐敗菌的感官評(píng)分變化趨勢(shì)基本一致。這主要是由于不同微生物的生長(zhǎng)速度和致腐能力不同，進(jìn)而造成生鮮面的腐敗程度也不同。

圖4 在25℃儲(chǔ)藏條件下接種腐敗菌的生鮮面感官評(píng)分的變化Fig.4 Thesensory scores changes of fresh noodles after inoculated with spoilage bacteria and stored at 25℃

2.3.2 酸度

酸度的變化是判斷生鮮面腐敗變質(zhì)的重要因素。在25℃儲(chǔ)藏條件下接種優(yōu)勢(shì)腐敗菌的生鮮面酸度的變化趨勢(shì)如圖5所示。由圖5可知，生鮮面酸度起始為0.80 mL/10 g，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，所有處理生鮮面的酸度總體都逐漸上升，在儲(chǔ)藏18 h后，酸度上升略微平緩，在儲(chǔ)藏30 h時(shí)達(dá)到最大值。接種不同微生物的生鮮面的酸度之間差異較大。其中，接種DX的生鮮面在儲(chǔ)藏30 h時(shí)酸度達(dá)到最大值，為4.46 mL/10 g，其次是接種DZ和DY的生鮮面，酸度分別達(dá)3.90 mL/10 g和3.70 mL/10 g。對(duì)照組的酸度整體低于接種優(yōu)勢(shì)菌株的樣品組的酸度。Li等[23]研究表明，酸度與微生物的增長(zhǎng)有顯著的正相關(guān)關(guān)系，主要是由于在儲(chǔ)藏過程中，微生物的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)物會(huì)造成生鮮面酸敗。

圖5 在25℃儲(chǔ)藏條件下接種腐敗菌的生鮮面酸度的變化Fig.5 The acidity changes of fresh noodlesafter inoculated with spoilage bacteria and stored at 25℃

2.3.3 pH值

pH值的變化是判斷生鮮面腐敗變質(zhì)的關(guān)鍵因素。25℃儲(chǔ)藏條件下接種腐敗菌的生鮮面pH值的變化趨勢(shì)如圖6所示。由圖6可知，生鮮面pH值起始為6.72，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，接種優(yōu)勢(shì)腐敗菌DX、DY和DZ的生鮮面的pH值都逐漸降低，在儲(chǔ)藏18 h后，pH值下降略微平緩，在儲(chǔ)藏30 h時(shí)pH值達(dá)到最小值。剛制備出的生鮮面的pH值在6.50左右，此條件下非常適合微生物的生長(zhǎng)[24]。隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，接種DX菌的生鮮面的pH值下降速率最快，在儲(chǔ)藏30 h時(shí)達(dá)到最小值，即pH值為5.07。其次是接種DZ的生鮮面，最后是接種DY的生鮮面，30 h時(shí)其pH值分別為5.24和5.58。此外，未接種腐敗菌的對(duì)照組的pH值都略高于其他3種，3株優(yōu)勢(shì)腐敗菌之間對(duì)生鮮面pH值的影響呈顯著性差異（P＜0.05）。引起生鮮面pH值下降的主要原因是在儲(chǔ)藏期間由于微生物的大量繁殖，使得生鮮面中的淀粉等碳水化合物被充分利用，產(chǎn)生了大量的有機(jī)酸等酸性產(chǎn)物，使得生鮮面的pH值不斷下降[25]。

圖6 在25℃儲(chǔ)藏條件下接種腐敗菌的生鮮面pH值的變化Fig.6 The pH values changes of fresh noodles after inoculated with spoilage bacteria and stored at 25℃

2.3.4 菌落總數(shù)

微生物的生長(zhǎng)繁殖所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物是引起生鮮面腐敗變質(zhì)的主要原因之一。其最明顯的特征就是生鮮面中菌落總數(shù)的變化，這是品質(zhì)變化的指標(biāo)之一[26-27]。在25℃儲(chǔ)藏條件下接種腐敗菌的生鮮面菌落總數(shù)的變化趨勢(shì)如圖7所示。由圖7可知，生鮮面菌落總數(shù)起始為2.86 lg（CFU·g-1），隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，菌落總數(shù)總體均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，其中接種DX菌的菌落總數(shù)變化最大，在儲(chǔ)藏30 h時(shí)達(dá)到最大值，即7.77 lg（CFU·g-1），高于其他3組，其次是DZ組，最后是DY組，菌落總數(shù)最大值分別為6.78lg（CFU·g-1）和6.62 lg（CFU·g-1），這與高磊等[28]研究的冷鮮雞腿肉中優(yōu)勢(shì)腐敗菌的菌落總數(shù)變化趨勢(shì)基本一致。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的主要原因可能是由于每種微生物的生長(zhǎng)代謝速度和致腐機(jī)制不同，從而造成菌落總數(shù)不同，其結(jié)果與3種優(yōu)勢(shì)腐敗菌在感官評(píng)分、酸度以及pH值方面對(duì)生鮮面品質(zhì)影響的結(jié)果大致相同。不同菌株的生長(zhǎng)情況會(huì)隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的不同呈現(xiàn)差異，但儲(chǔ)藏后期因?yàn)樗犷悺奉惖却x產(chǎn)物的逐漸增多，又會(huì)反過來抑制微生物的生長(zhǎng)[29]。

圖7 在25℃儲(chǔ)藏條件下接種腐敗菌的生鮮面菌落總數(shù)的變化Fig.7 Thetotal coloniesnumberschanges of fresh noodlesafter inoculated with spoilage bacteria and stored at 25℃

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過形態(tài)學(xué)鑒定篩選出3株生鮮面中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，再借助生理生化手段和16SrDNA序列分析法對(duì)3株優(yōu)勢(shì)腐敗菌進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果表明3株優(yōu)勢(shì)腐敗菌分別為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌。將鑒定出的3株優(yōu)勢(shì)腐敗菌回接到生鮮面中，以不同儲(chǔ)藏時(shí)間生鮮面的感官評(píng)分、酸度、pH值和菌落總數(shù)為指標(biāo)，綜合評(píng)價(jià)優(yōu)勢(shì)腐敗菌對(duì)生鮮面致腐能力的大小。結(jié)果表明3株優(yōu)勢(shì)腐敗菌的致腐能力為：枯草芽孢桿菌＞蠟狀芽孢桿菌＞地衣芽孢桿菌。這為生鮮面的保鮮提供了依據(jù)。