CIP2A和FOXA1在直腸癌中的表達關系及診斷價值*

靳迎春，周 津，崔 穎

(新疆軍區總醫院消化內科，烏魯木齊 830000)

直腸癌是世界范圍內較為常見的惡性腫瘤之一，近年來，中國的直腸癌發病率、病死率均有所上升[1]。因此，早診斷、早治療對于直腸癌患者具有重要的臨床意義。蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)是一種普遍存在于惡性腫瘤中的致癌因子[2]，報道稱，CIP2A可與癌轉錄因子c-Myc蛋白特異性結合，抑制c-Myc蛋白水解，促進細胞增殖及惡性轉化，加速體內腫瘤形成[3]。叉頭盒蛋白(FOXA1)是轉錄因子FOX家族成員之一，最早在果蠅體內發現[4]，后發現其可與新陳代謝相關基因的啟動子結合，在調控癌細胞信號通路和活性方面發揮重要作用[5]。有研究發現，FOXA1在乳腺癌中通過抑制上皮間質轉化作用參與癌癥的發展過程，在乳腺癌組織中陽性表達率降低預示預后良好[6]。有關CIP2A、FOXA1在直腸癌中的研究國內外鮮有報道，因此，本研究通過檢測CIP2A、FOXA1在直腸癌患者組織中的表達水平，分析二者與臨床病理間的關系，預測其對直腸癌的診斷價值，以期為臨床診斷提供新的指導依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6月至2019年9月在本院胃腸腫瘤外科診治的63例直腸癌患者為研究對象，其中男41例，女22例，年齡31～76歲，平均(57.81±6.43)歲。所有患者均獲病理診斷，且行直腸癌根治術。收集癌組織和癌旁組織標本，標本采集方法：癌組織取自癌中心部位，癌旁組織取自距腫瘤邊緣5 cm處肉眼可見無瘤組織，組織大小約為1 cm×1 cm×1 cm，所有組織采集后貼好標簽均置于液氮中保存。

納入標準：(1)術前未經化療或放療處理；(2)均為首次治療；(3)非急診手術病例；(4)臨床資料完整。排除標準：(1)合并嚴重心、肝、腎等重要臟器損害者；(2)嚴重基礎代謝疾病患者；(3)合并傳染性疾病患者；(4)合并精神障礙、癔癥等。患者及家屬均知情同意本次研究并自愿簽署知情同意書。本研究獲得本院倫理委員會審核批準。

1.2 材料與試劑

免疫組織化學試劑盒、DBA染色劑購自上海古朵生物科技有限公司，兔抗人CIP2A多克隆抗體、兔抗人FOXA1多克隆抗體均購自北京索萊寶科技有限公司；TRIzol試劑、反轉錄試劑盒、PCR擴增試劑盒購自北京博奧森生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1細胞培養

人直腸癌細胞系SW480、SW620、HCT-15細胞及HIEC健康人腸上皮細胞株購自中國科學院細胞庫，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液(美國Gibcp公司)置于含體積分數5% CO2的37 ℃培養箱中進行培養，每1～2天傳代1次，傳代時吸取瓶中培養液，輕輕吹打瓶壁，使細胞脫落形成單個細胞懸液，取對數期細胞進行檢測。

1.3.2免疫組織化學法檢測CIP2A和FOXA蛋白表達

本研究采用免疫組織化學法，用癌旁正常直腸組織做陰性對照，操作步驟嚴格按照說明書進行。在低倍鏡下選擇3個不重復的視野，在高倍鏡下計數100個細胞中陽性細胞所占比例，取3個視野作平均值。

采用半定量方法對CIP2A、FOXA1陽性結果進行判定：按細胞染色強度計分：細胞未著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕黑色計3分；按陽性細胞所占百分比計分：陽性細胞為0計0分，<25%計1分，25%～50%計2分，>50%計3分。染色強度與陽性細胞所占百分比乘積≥2分判定為免疫組織化學陽性(+)，否則為陰性(-)。

1.3.3實時熒光定量反轉錄-聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)檢測CIP2A和FOXA1 mRNA的相對表達水平

利用qRT-PCR檢測CIP2A和FOXA1的mRNA表達水平。取液氮保存的組織50～100 mg研磨，或取各組細胞，加入TRIzol溶液1 mL裂解，提取總RNA。利用NanoDropND-1000分光光度儀(NanoDrop Tech，美國)檢測RNA濃度。使用PrimeScript RT反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，反轉錄試劑盒、PCR擴增試劑盒均嚴格按照說明書操作步驟執行。CIP2A和FOXA1均以GAPDH為內參。引物序列由生工生物工程公司合成，見表1。用2-ΔΔCt法計算CIP2A和FOXA1 mRNA表達水平。

表1 引物序列

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 直腸癌組織和癌旁組織中CIP2A和FOXA1表達情況比較

CIP2A和FOXA1在直腸癌組織中的陽性表達率分別為82.54%(52/63)和80.95%(51/63)，明顯高于癌旁組織的12.70%(8/63)和11.11%(7/63)，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1、表2。

A：CIP2A在癌旁組織中的表達;B:CIP2A在直腸癌組織中的表達；C：FOXA1在癌旁組織中的表達；D：FOXA1在直腸癌組織中的表達。

表2 人直腸癌細胞及健康人腸上皮細胞中CIP2A、FOXA1 mRNA及蛋白的表達

2.2 人直腸癌細胞及健康人腸上皮細胞中CIP2A、FOXA1 mRNA及蛋白的表達

CIP2A、FOXA1 mRNA及蛋白在人直腸癌細胞中的表達水平均明顯高于健康人腸上皮細胞(P<0.05)，在不同株癌細胞中的表達差異無統計學意義(P>0.05)，見表2、圖2。

圖2 人直腸癌細胞及健康人腸上皮細胞中CIP2A、FOXA1的表達情況

2.3 CIP2A和FOXA1表達水平與直腸癌患者臨床病理特征的關系

CIP2A和FOXA1表達水平與患者年齡、性別、腫瘤大小無關(P>0.05)，與TNM分期、分化程度和淋巴結是否轉移有關(P<0.05)，見表3。

表3 CIP2A和FOXA1表達水平與直腸癌患者臨床病理間的關系(n)

2.4 直腸癌組織和癌旁組織中CIP2A和FOXA1 mRNA表達水平

直腸癌組織中CIP2A和FOXA1 mRNA表達水平均顯著高于癌旁組織(P<0.05)，見表4。

表4 直腸癌組織和癌旁組織中CIP2A、FOXA1 mRNA表達水平比較

2.5 CIP2A和FOXA1對直腸癌的診斷價值

ROC曲線結果顯示，CIP2A診斷直腸癌的曲線下面積(AUC)為0.854(95%CI:0.781～0.911)，截斷值為1.40，約登指數為0.651，其靈敏度、特異度分別為66.67%、91.84%；FOXA1診斷直腸癌的AUC為0.904(95%CI:0.839～0.950)，截斷值為1.19，約登指數為0.667，其靈敏度、特異度分別為84.13%、82.54%；兩者聯合診斷直腸癌的AUC為0.936(95%CI:0.905～0.958)，約登指數為0.794，其靈敏度、特異度分別為92.06%、87.30%。見圖3。

圖3 CIP2A、FOXA1診斷直腸癌的ROC曲線

3 討 論

直腸癌是一種常見惡性腫瘤，手術切除是臨床上常用的治療方法，但術后患者易發生遠處轉移，復發率較高，預后差[7]。因此，尋找有效標志物評估患者病情對臨床診斷和治療干預具有重要意義。

CIP2A由KIAA1524基因編碼，該基因位于3號染色體上，由21個外顯子組成，主要在細胞質中表達[8]。報道稱，CIP2A在正常腸組織或黏膜中不表達或低表達，在腸癌等腫瘤疾病中高表達[9]。黃文峰等[10]研究發現，CIP2A在大腸癌組織中表達陽性率為66.33%，與大腸癌TNM分期呈正相關，COX回歸分析顯示其高表達可能是評估患者預后不良的獨立危險因素，提示CIP2A可作為監測及判斷大腸癌預后的指標。戈銳等[11]研究表明，結直腸癌患者癌組織中CIP2A及c-Myc表達均升高，并揭示了其促腫瘤生長的可能途徑，可能與細胞周期調控蛋白基因的遺傳性改變有關。大量研究表明，CIP2A作為腫瘤抑制因子，通過與其對應靶基因共同作用，減少細胞生長阻滯，過表達可能促進細胞增殖、分化[11]。本研究結果顯示，CIP2A在直腸癌組織中的陽性表達率為82.54%，顯著高于癌旁組織的12.70%，直腸癌組織中CIP2A mRNA表達水平顯著高于癌旁組織，進一步細胞實驗結果表明，CIP2A在直腸癌細胞中的表達水平明顯高于正常細胞，且與患者TNM分期、分化程度和淋巴結轉移有關，提示CIP2A可能參與直腸癌細胞的增殖、分化，進而影響直腸癌的發生、發展過程。

人類FOXA1基因位于染色體14q12-q13，其蛋白質由472個氨基酸組成，相對分子質量為50×103。研究發現，FOXA1可通過與染色體特異性結合，釋放DNA結合位點，進而調控細胞增殖、凋亡、轉化及信號傳導等過程[12]。LAURA[13]研究發現，發生FOXA1基因突變的患者，前列腺特異性抗原復發時間縮短，提示FOXA1突變可能對ERG融合相關前列腺癌有一定的預后價值。FOXA1是FOX家族中重要成員之一，是一種典型的與細胞增殖有關的轉錄因子，已有報道稱其在卵巢上皮癌[13]、非小細胞肺癌[14]的發生、發展中發揮重要作用。

ZHANG等[15]采用免疫組織化學法檢測發現，FOXA1在結直腸腺瘤組織、結直腸癌黏膜、正常結直腸黏膜中的陽性表達率依次降低且差異顯著，提示FOXA1可能參與結直腸腺瘤的癌變。本研究結果顯示，FOXA1在直腸癌組織中的陽性表達率為80.95%，顯著高于癌旁組織的11.11%，直腸癌組織中FOXA1 mRNA表達水平顯著高于癌旁組織，且與患者TNM分期、分化程度和淋巴結轉移有關，細胞實驗證實FOXA1在直腸癌細胞中的表達水平明顯高于正常腸上皮細胞，提示FOXA1過表達可能起促癌作用，參與直腸癌的發生、發展過程。

本研究還探究了CIP2A、FOXA1表達水平對直腸癌的診斷價值，ROC曲線結果顯示，CIP2A、FOXA1診斷直腸癌的AUC分別為0.854、0.904，當CIP2A相對表達水平高于1.40，FOXA1相對表達水平高于1.19時，發生直腸癌的概率增加，提示CIP2A、FOXA1對直腸癌的發生具有一定的診斷價值；為更好診斷直腸癌，作CIP2A、FOXA1二者聯合診斷，結果顯示聯合診斷直腸癌的AUC為0.936，此時靈敏度和特異度分別為92.06%、87.30%，提示CIP2A、FOXA1二者聯合診斷直腸癌的價值更高。

綜上所述，CIP2A、FOXA1在直腸癌組織中呈高表達，且與患者TNM分期、分化程度和淋巴結轉移密切相關，提示CIP2A、FOXA1在直腸癌的發生、發展過程中起重要作用，對直腸癌具有一定的診斷價值，可作為臨床診斷和治療的分子標志物，有望成為直腸癌患者治療上的新靶點。