呼吸道菌群負擔和多樣性與危重患者預后的相關性分析*

魏立娜,李真玉,張 華,劉易峰

(1.天津醫科大學第二醫院，天津 300211;2.天津醫科大學護理學院，天津 300070)

隨著人們對微生態的認識加深，不同器官部位微生態變化與相應疾病進展的相關性逐漸得到關注，許多有價值的發現給臨床工作帶來了寶貴的啟示[1]。呼吸道菌群由共生和病原微生物組成，年齡、病情嚴重程度、機體生理功能可影響肺部菌群的負荷、豐度和多樣性[2]，菌群特點變化在許多肺部疾病發生、進展、急性發作中起到重要作用[3-4]，但具體機制尚不明確。研究表明，呼吸道菌群與慢性阻塞性肺疾病(COPD)進展、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)發生和住院病死率相關，微生態平衡對疾病預后的作用不可忽視[5]。重癥監護室(ICU)患者原發病重、全身情況差、常伴有感染，導致肺部微生物群落改變，后者反過來促進病情進展和不良預后發生[6]。然而，國內目前在這一領域少有相關研究，本文旨在深入探索ICU患者呼吸道菌群與死亡率相關性，豐富人體微生態研究，為ICU臨床工作帶來啟示，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2020年4月天津醫科大學第二醫院ICU收治的232例患者為研究對象。納入標準：(1)因呼吸、心血管、神經系統疾病，以及腫瘤、中毒等引起的器官功能障礙、呼吸衰竭、頑固性心力衰竭等病情危重者；(2)年齡大于18歲；(3)ICU住院時間大于3 d至小于28 d；(4)因肺部感染、肺間質性疾病、痰液滯留等原因必要或自愿行支氣管肺泡沖洗者；(5)患者或家屬已簽署知情同意書。排除標準：(1)具有近期活動性大咯血、活動性肺結核等支氣管肺泡灌洗禁忌證者；(2)妊娠、近期有糖皮質激素或免疫抑制劑應用史者；(3)預計生存時間小于或等于24 h者；(4)嚴重創傷者。根據是否在ICU死亡分為存活組和死亡組。所有患者中男125例，女107例，平均年齡(49.78±17.26)歲；入ICU病因：呼吸系統疾病95例(40.95%)，神經系統疾病31例(13.36%)，心血管系統疾病43例(18.53%)，消化系統疾病24例(10.34%)，其他39例(16.81%)。本研究經過醫院倫理委員會審核批準。

1.2 方法

1.2.1病例采集

排除臨床資料不全和自動出院病例，收集患者入院病歷中相關資料，包括：年齡、性別、既往史、急性生理功能和慢性健康狀況評分系統Ⅱ(APACHEⅡ)評分、序貫器官衰竭估計(SOFA)評分、血生化檢查結果等。所有患者于入ICU第1天行支氣管肺泡沖洗，回收沖洗液以行DNA提取。

1.2.2APACHEⅡ和SOFA評分[7]

根據患者年齡、血壓、肝腎功能、手術史等資料進行APACHEⅡ評分，評分越高表示全身情況越差。SOFA評分涉及呼吸、凝血、肝臟、神經、泌尿、循環系統，每個系統0～4分，總分24分，評分越高則器官功能越差。

1.2.3呼吸道菌群標本采集與DNA提取

入ICU 24 h內應用生理鹽水對患者行支氣管肺泡沖洗操作，回收沖洗液，4 ℃保存。將沖洗液于14 000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀物用200 μL的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸。應用DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)和PCR擴增試劑盒(加拿大Fermentas公司)抽提懸浮物中DNA，操作依據說明書。

1.2.4引物設計和PCR擴增

細菌基因組16S rDNA的V3～V5區序列由GenBank數據庫[8]提供，片段長度550 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。應用上述引物進行PCR擴增，PCR反應程序為預變性(95 ℃、3 min)，變性(95 ℃、30 s)，退火(56 ℃、30 s)，延伸(72 ℃、30 s)，行35個循環，于4 ℃下保存。

1.2.5測序結果

行16S rDNA拷貝數、豐度、多樣性分析，擴增產物經純化后由深圳華大基因研究院完成16S rDNA宏基因組測序與定量，在PCR產物中加入樣品標簽序列，然后行混合測序，根據基因表達標簽分類細菌物種、分析群落豐度、多樣性等。菌落多樣性采用Mothur軟件計算，應用Alpha多樣性分析根據實際觀測到的OTU數目評估，群落豐度觀察指標選取chao、sobs、ace指數，數值越大則豐度越高；群落多樣性采用simpson和shannon指數評估，前者數值越大則多樣性越低，后者反之。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 兩組一般資料比較

存活組和死亡組各排除資料不完整或自動出院者7例和2例，最終納入223例。58例(26.01%)于ICU內死亡，其中11例直接死因為感染，其余死于原發病進展；死亡組APACHEⅡ評分、SOFA評分、急性腎損傷比例均高于存活組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組呼吸道菌群負荷和多樣性比較

死亡組16S rDNA拷貝數、simpson指數高于存活組，chao、sobs、shannon、ace指數低于存活組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組呼吸道菌群負荷和多樣性比較

2.3 ICU患者死亡相關因素logistic回歸分析

APACHEⅡ評分、SOFA評分、16S rDNA拷貝數為ICU患者死亡危險因素(P<0.05)；chao指數、sobs指數、shannon指數、ace指數為保護因素(P<0.05)，見表3。

表3 ICU患者死亡相關因素logistic回歸分析

3 討 論

呼吸道擁有復雜的菌群系統，越來越多的學者發現肺部微生態平衡遭到破壞后，促進了肺部疾病和不良結局的發生[9-10]。ICU患者作為一個預后普遍較差的群體，所具有的病情不穩定、生理紊亂嚴重、致病機制復雜等因素嚴重破壞了人體微生態平衡，既往研究多集中于腸道菌群，而失衡的肺部菌群環境推動了ARDS、呼吸機相關性肺炎、不良預后的發生[11-12]，呼吸道微生態或在促進患者死亡中扮演著特殊的角色[13]。因此，本文基于此點，挖掘ICU患者呼吸道菌群與死亡率的相關性，旨在為干預患者預后帶來新的思路。

良好的生理狀態和器官功能是支撐ICU患者好轉的基礎，本研究中死亡組APACHEⅡ評分和SOFA評分均高于存活組，APACHEⅡ評分和SOFA評分為ICU患者死亡危險因素。APACHEⅡ評分和SOFA評分可準確反映患者機體狀態和器官功能，與預后相關，兩者已被廣泛應用于許多疾病和危重病患者的預后評估中[14-15]。王力鵬等[16]報道APACHEⅡ和SOFA評分與急診重癥患者死亡風險相關，可有效預測預后，支持了本研究結論。

本研究對比ICU內死亡患者和存活患者的呼吸道菌群負荷，觀察到死亡組16S rDNA拷貝數高于存活組，16S rDNA拷貝數為ICU患者死亡危險因素。ICU患者在身體機能欠佳、生理狀態改變、感染風險高的基礎上長時間接觸大量病原體，這些都可能是呼吸道細菌數量增多的原因，不論是哪一者都將影響患者預后。DICKSON等[17]報道在膿毒癥、ARDS、重癥疾病狀態下，肺部菌群負荷增多、群落組成改變，其中最突出的變化是肺內腸桿菌科成為優勢菌群，而本研究未對ICU患者呼吸道菌群成分進行分析、未明確呼吸道菌群負荷增多原因，有待完善。

肺部微生態的穩定主要取決于菌群的組成、豐度和多樣性，本文中死亡組simpson指數高于存活組，chao、sobs、shannon、ace指數均低于存活組；chao指數、sobs指數、shannon指數、ace指數為ICU內死亡的保護因素。死亡組入ICU 24 h內菌群豐度和多樣性較低，可能是由致病菌繁殖和共生菌減少引起，并與預后相關。BUDDEN等[18]報道發生肺炎、肺囊性纖維化、ARDS等疾病時，患者呼吸道優勢菌群和菌群多樣性發生改變，這種改變與感染、病情進展可能存在相互作用的關系。另有研究表明肺部菌群負荷、組成成分、多樣性與ICU患者未使用呼吸機時間相關，肺內腸桿菌的富集與患者發生ARDS有關，肺部菌群負荷、組成成分、多樣性可預測ICU患者預后[19]。這些結論均給本研究提供了一定理論支持。本文通過細菌載量、豐度、多樣性證實ICU死亡患者肺部菌群變化，升高的細菌載量和降低的多樣性反映了菌群組成變動，可能伴隨著優勢菌群的改變，但本文未探索患者肺部菌群組成，此乃不足之處。同時本研究論證了危重病患者肺內菌群狀態與預后相關，關于人體微生態的研究往往集中于腸道菌群，下呼吸道菌群由于采樣困難常被忽視，但越來越多的證據指出肺部微生態平衡可能是改善許多疾病患者預后的重要途徑[20]。然而，呼吸道菌群在ICU患者發病、進展、死亡過程中的具體機制尚未明確，可能是通過推動感染和ARDS發生加重器官功能負擔，亦或是危重病情與肺部菌群相互作用的結果，需更多研究加以證實。

綜上所述，呼吸道微生態平衡和ICU患者病死率相關，深入對肺部菌群變化的探索，有助于為危重病患者提供更多改善方案。