基于CaMkkβ/AMPK通路介導線粒體自噬探討斂肝熄風止顫方的神經保護機制

王春玲 羅寧 蔣媛靜 蒙冰 左曜瑋 李昌海 文曉東

摘要 目的：觀察斂肝熄風止顫方對帕金森病（Parkinson Disease，PD）的影響，探討其神經保護機制。方法：將60只SD大鼠分為假手術組10只，造模組50只，造模組大鼠接受PD模型制備，將成模的40只大鼠隨機分為模型組10只、低劑量組（0.36 g/kg）10只、中劑量組（0.72 g/kg）及高劑量組（1.44 g/kg）10只，持續灌胃給藥30 d，比較各組大鼠阿撲嗎啡誘導旋轉次數、圓筒實驗，紋狀體超微結構以及CaMkkβ、AMPK、p-AMPK水平的變化。結果：1）斂肝熄風止顫方可明顯減少大鼠轉圈以及肢體碰壁的次數，隨著劑量增加次數減少更明顯，差異有統計學意義（P<0.05）。2）造模大鼠紋狀體線粒體自噬現象減弱，斂肝熄風止顫方可明顯促進腦組織線粒體自噬。3）中藥干預后大鼠紋狀體CaMkkβ、p-AMPK蛋白表達上調，與模型組比較，差異有統計學意義（P<0.05），其中高劑量組較低劑量組上調明顯，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：斂肝熄風止顫方對帕金森病具有神經保護作用，其機制之一可能是通過激活CaMkk/AMPK通路活性促進線粒體自噬有關。

關鍵詞 帕金森病;斂肝熄風止顫方;機制;線粒體;自噬;神經保護;CaMkkβ/AMPK通路

Study on the Neuroprotective Mechanism of Lianggan Xifeng Zhichan Formula Based

on Mitochondrial Autophagy Mediated by CaMkkβ/AMPK Pathway

WANG Chunling1，LUO Ning2，JIANG Yuanjing2，MENG Bing2，ZUO Yaowei1，LI Changhai1，WEN Xiaodong2

（1 College of Pharmacy，Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530001，China; 2 Department of

Neurology，Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530011，China）

Abstract Objective：To observe the effect of Lianggan Xifeng Zhichan Formula （LGXFZC） on Parkinson′s disease （Parkinson′s disease，PD） and explore its neuroprotective mechanism.Methods：A total of 60 SD rats were divided into a sham operation group （n=10） and a model group （n=50）.The rats in the model group were made by PD model.40 rats were randomly divided into a model group （n=10），a low dose group （0.36 g/kg） （n=10），a middle dose group （0.72 g/kg） and a high dose group （1.44 g/kg） for 30 days.The rotation times of apomorphine，cylinder test，ultrastructure of striatum and the levels of CaMkk β，AMPK and p-AMPK were compared in each group.Results：1） LGXFZC could significantly reduce the frequency of rotation and limb touching wall in rats.As the dose increases，the frequency decreases more obviously.The difference was statistically significant （P<0.05）.2） the phenomenon of mitochondrial autophagy in striatum of model rats was weakened，and LGXFZC could obviously promote mitochondrial autophagy in brain tissue.3） after the intervention of Chinese medicine，the expression of CaMkk β and p-AMPK protein in the striatum of rats was significantly higher than that in the model group （P<0.05），and compared with the model group，the difference is statistically significant （P<0.05）.Among them，the high-dose group and the lower-dose group were up-regulated significantly （P<0.05）.Conclusion：LGXFZC has neuroprotective effect，and one of its mechanisms may be that it promotes mitochondrial autophagy by activating the activity of CaMkk/AMPK pathway.

Keywords Parkinson′s disease; Linggan Xifeng Zhichan Formula; Mechanism; Mitochondria; Autophagy; Neuroprotection; CaMkk β/AMPK pathway

中圖分類號：R289.5;R741文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.05.015

帕金森病（Parkinson Disease，PD）是臨床常見的神經退行性疾病，以黑質-紋狀體多巴胺能神經元進行性丟失為主要病理學改變[1]，嚴重影響患者的日常工作和生命質量。因此，尋找安全有效的治療PD手段，是神經醫學及康復醫學迫切需要解決的課題。線粒體自噬是清除/降解受損線粒體的過程，是有效阻斷受損線粒體導致細胞死亡的關鍵[2-3]。另一方面，線粒體自噬過程中產生脂肪酸、氨基酸等小分子物質將重新參與機體組織細胞的物質代謝，有研究顯示帕金森病的發生發展與線粒體自噬減弱關系密切，調控線粒體自噬對治療PD多巴胺能神經元損傷有重要的意義[4-5]。

斂肝熄風止顫方首載于《傷寒論·厥陰病》，有斂肝熄風、養血濡筋的作用，臨床顯示將該方用于治療PD，確具有一定的療效[6]，但其機制仍需進一步研究。本研究利用PD大鼠模型對該方治療PD的作用機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

50只雄性SD（Sprague Dawley）大鼠納入研究，體質量230～260 g，平均體質量（240±10.50）g，均購自凱學生物科技（上海）有限公司（注冊號91310120MA1HK1JC5H），飼養于無特定病原體動物（SPF）級別的動物實驗室，飼養環境為12 h/12 h晝夜交替，溫度（22±1）℃，濕度（50±2）%。動物的處置符合實驗動物倫理學原則。

1.1.2 藥物

斂肝熄風止顫方藥物組成如下：烏梅20 g、黃連3 g、白芍20 g、當歸10 g、熟附子10 g、熟地黃10 g、何首烏20 g、川芎10 g、葛根20 g、人參10 g、石菖蒲5 g、天麻10 g、龜甲10 g、炙甘草3 g。由本院藥房統一煎制，熬成100 mL藥液。生藥均購于本院藥劑科并由其提供正品鑒定。

相當于藥材量10倍的蒸餾水浸泡30 min，開始時用水量高過藥面2～5 cm。煮沸后，文火30 min，用紗布過濾，倒出藥汁，再將藥材量8倍水倒入藥材中，煮沸后，文火30 min，將2次的藥汁合并，濃縮至1.06 g/mL。大鼠灌胃藥液的劑量按照人/鼠公斤體質量的等效劑量計算。

1.1.3 試劑與儀器

6-OHDA（Sigma公司，美國，貨號：28094），CaMkk一抗抗體（CST公司，美國，貨號：12716T），AMPK一抗抗體（CST公司，美國，貨號：9158S），p-AMPK一抗抗體（CST公司，美國，貨號：5759S），一抗抗體（CST公司，美國，貨號：4970T），堿性磷酸酶標志物（上海遠慕科技有限公司，貨號：ym-c0311P-AP），酶標自動分析儀（BIO-BAD公司，美國，型號：Centrifuge MiniSpin），電泳槽（Bio-rad，美國，型號：1658033），轉膜儀（Bio-rad，美國，型號：165-800），脫色搖床（Leica，德國，型號：S6E），凝膠成像系統（Bio-rad，美國，型號：GELDoc Go），PCR擴增儀（Bio-rad，美國，型號：T100），電子分析天平（Leica，德國，型號：SECURA225D-1CN）等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

分組：研究將60只SD大鼠分為假手術組10只，造模組50只，造模組大鼠接受PD模型制備，將成模的40只大鼠隨機分為模型組10只、低劑量組（0.36 g/kg）10只、中劑量組（0.72 g/kg）10只及高劑量組（1.44 g/kg）10只。

模型制備[7]：參照文獻中的PD模型制備方法進行復制，具體如下：利用10%水合氯醛（3.5 mL/kg）對大鼠進行充分麻醉后固定于腦立體定位儀上，準確定位左側紋狀體，將6-OHDA（5 μg/μL）注射至左側紋狀體，隨后常規縫合皮膚，術后常規給予慶大霉素肌內注射預防感染，假手術組大鼠僅接受切開皮膚后縫合處理。造模術14 d對大鼠進行旋轉行為測試。造模成功標準：大鼠恒定右轉，轉速≥7 r/min，30 min內轉圈次數>150 r/min。

1.2.2 給藥方法

根據人/鼠公斤體質量的等效劑量計算方法，本研究的斂肝熄風止顫方生藥量為7.5 g/kg，去藥渣合并藥液后對藥汁進行濃縮，利用婆梅氏比重計對濃縮后藥汁的濃度進行測量，使最終藥液濃度為1.06 g/mL。隨后對中藥組大鼠進行低劑量（0.36 g/kg）、中劑量（0.72 g/kg）、高劑量（1.44 g/kg）斂肝熄風止顫湯，分別相當于按人和動物體表面積比率換算的臨床等效劑量的1/2、1、2倍，各給藥組灌胃給藥，假手術組及模型組大鼠接受等容積生理鹽水干預。1次/d，各組均連續干預30 d。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 APO誘導下轉圈次數

造模成功后及藥物干預30 d后大鼠腹腔注射APO（0.5 mg/kg），注射10 min后計算大鼠30 min向右側的轉圈次數。

1.2.3.2 圓筒實驗

造模成功后及藥物干預30 d各組隨機抓取3只大鼠置于透明有機玻璃圓筒中，裝置大小約20 cm×30 cm，圓筒前置一鏡子，記錄大鼠左前肢與左后肢與筒壁接觸次數，并根據參考文獻計算肢體碰壁比率，如左前肢碰壁比率=（a+c）×0.5/（a+b+d）。a：左前肢接觸筒壁的次數。b：單只前肢保持接觸筒壁，另一只前肢接觸筒壁次數及雙上肢同時接觸筒壁的次數。c：雙上肢同時接觸筒壁的次數。d：右前肢接觸筒壁的次數。

1.2.3.3 透射電鏡觀察紋狀體線粒體結構

干預結束后各組隨機抓取3只大鼠左側紋狀體修剪成大小1 cm3后置于電鏡固定液，固定48 h后利用PBS樣本漂洗3次后置于1%鋨酸和0.2 mol/L PBS 1∶1的緩沖液，在室溫條件下后固定1.5 h，繼續漂洗3次后用梯度乙醇脫水，脫水結束后將樣本置于包埋劑中充分浸透后用環氧樹脂包埋樣本，手工修切將樣本切成超薄切片后用醋酸雙氧鈾+檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察，拍片。

1.2.3.4 Western Blotting法檢測各組紋狀體CaMkkβ、AMPK、p-AMPK蛋白濃度的變化

取大鼠3只/組紋狀體腦組織200 mg加1 mL裂解緩沖液，4 ℃，15 000 r/min，離心，冰浴中超聲，20 s/次，間隔20 s，共5次，1 h取上清，取25 μL測蛋白含量。BCA法測蛋白濃度，用凝膠加樣緩沖液將各管蛋白濃度調為一致（2 mg/mL），取20 μL樣品煮沸5 min。電泳（5%濃縮膠，12%分離膠，60 V，40 mA，2.5 h）結束后將凝膠取出，進行轉膜，遵循膠在負極，膜在正極的原則，100 V，250 mA，時間依據各指標分子量大小而定，將硝酸纖維素膜取出，5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗3次，每次5 min，分別加入抗CaMkkβ、AMPK、p-AMPK、β-actin一抗抗體孵育，4 ℃過夜TBST洗2次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標記與一抗相人如抗的二抗IgG（1∶2 000）室溫50 min，TBST洗3次，每次5 min。將濾膜放入配好的顯色液中反應1 min，采用Tanon軟件拍攝圖像并進行半定量分析。

1.3 統計方法

采用SPSS 22.0統計軟件對數據進行分析處理，本研究采集的數據用均數±標準差（±s）表示，計量資料用多因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組行為學的改變

經過造模后大鼠轉圈以及肢體碰壁的次數明顯增加，利用斂肝熄風止顫方干預后大鼠肢體碰壁的次數減少，與模型組比較差異有統計學意義（P<0.05），并隨著斂肝熄風止顫方劑量增加，次數減少越明顯（P<0.05）。見表1、表2。

2.2 各組超微結構變化

假手術組大鼠紋狀體細胞器結構完整，線粒體嵴明顯，未出現斷裂現象，細胞核形態正常，核膜完整;模型組組織出現明顯空泡病變，線粒體嵴斷裂明顯，染色體流式明顯，細胞器溶解明顯;斂肝熄風止顫方干預后組織受損情況較模型組改善，部分線粒體嵴出現斷裂，程度較模型組改善，糖原分布交不均勻，且高劑量組較低劑量組改善明顯。見圖1。

2.3 各組紋狀體CaMkkβ、AMPK、p-AMPK蛋白濃度的變化

造模后大鼠紋狀體體CaMkkβ、p-AMPK蛋白表達明顯減少，與假手術組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。中藥干預后大鼠紋狀體CaMkkβ、p-AMPK蛋白表達上調，與模型組比較，差異有統計學意義（P<0.05），其中高劑量組較低劑量組上調明顯，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2、表3。

3 討論

自噬是機體正常的細胞代謝過程，是用來降解的功能受損/失調的細胞器、多余的細胞質內容物或錯誤折疊的蛋白質，該過程在真核生物生理或病理過程均可見到[8-10]。線粒體自噬是機體清除功能受損線粒體的唯一途徑，以減少呼吸活動和降低膜電位的途徑對線粒體的完整性進行維持，此過程中機體活性氧簇的分泌減少，確保細胞內線粒體有足夠的能量供應。文獻[11-13]顯示PD的發生發展與線粒體的自噬密不可分。線粒體的自噬受到諸多生物因素的調控，其中CaMkkβ/AMPK通路是目前已知的與線粒體關系密切的信號通路之一。CaMKKβ是AMPK特有激酶，可將AMPK激活，一旦AMPK被激活后可間接活化TSC2，從而抑制其下游蛋白mTOR的活性，促進自噬。研究顯示，CaMkkβ/AMPK通路介導線粒體自噬過程[14-16]，一旦CaMkkβ/AMPK通路被激活則促進細胞的自噬能力。因此，某種干預措施如果可激活CaMkkβ/AMPK通路，則可提高細胞的自噬能力，從而改善PD病情。本研究復制PD模型，利用透射電鏡對紋狀體組織細胞的超微結構進行觀察，結果顯示經過模型組大鼠紋狀體組織細胞的自噬能力確明顯增加，破壞了線粒體結構的完整性，同時利用Western Blotting手段檢測了CaMkkβ/AMPK通路蛋白的表達水平，可知模型組大鼠紋狀體的CaMkkβ、p-AMPK表達均被抑制，這進一步驗證了PD發生時確伴隨紋狀體組織細胞線粒體自噬能力的減弱，同時出現CaMkkβ/AMPK通路的被抑制。

PD屬于中醫學“顫證”范疇，從中醫角度認為顫證的病位在厥陰，肝和心包的臟腑經絡氣化乃該病之基礎。足厥陰肝經與手厥陰心包經是兩陰交盡，一陽初生之地，肝藏血，在體合筋，正如《素問·經脈別論》云：“食氣入胃，散精于肝，淫氣于筋。”肝血充足則筋得其所養，肝血匱乏則筋脈失養，拘急痙攣，肝腎虧虛陰風內動，同氣相求則震顫抖動，故發為本病[17-18]。斂肝熄風止顫方首載于《傷寒論》，方中烏梅為君藥，本品來“補肝之猛將”，是養肝柔筋之良藥，肝補而陰風不起;龜甲可滋陰潛陽，何首烏和熟地黃共奏補益肝腎、固精生血之功效;白芍可滋陰柔肝，天麻潤而不燥，主入肝經，長于平肝息風，凡肝風內動、頭目眩暈之癥，不論虛實，均為要藥。當歸、川芎可行氣補血活血，葛根可解肌舒筋通絡。PD病程日久，虛實寒熱錯雜，人參大補元氣，扶正祛邪，黃連清熱。諸藥合用肝腎雙補，祛風柔筋，使得肝腎精血得補，陰陽平衡得以調整，髓海充盈，祛風柔筋止顫。本研究利用斂肝熄風止顫方干預PD模型鼠，結果顯示斂肝熄風止顫方可明顯抑制線粒體自噬能力，抑制CaMkkβ/AMPK通路過度激活，從而改善PD模型鼠的行為學能力。

總之，通過實驗研究我們認為斂肝熄風止顫方對具有神經保護作用，其機制之一可能是通過激活CaMkk/AMPK通路活性促進線粒體自噬有關。

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（2019-11-30收稿 責任編輯：楊覺雄）

基金項目：廣西衛生廳立項項目（Z2016220）;廣西中醫藥大學2018年廣西一流學科建設項目重點課題（2018XK089）

作者簡介：王春玲（1974.12—），女，博士，講師，研究方向：神經變性疾病的藥理研究，E-mail：osgsssdg@163.com

通信作者：文曉東（1973.02—），男，博士，副主任醫師，科主任，研究方向：帕金森病的中西醫防治，E-mail：21643438@qq.com