梔子苷對雙酚A致鯉魚肝毒性的保護作用

顧鄭琰 賈睿 何勤 曹麗萍 杜金梁 徐跑 殷國俊

摘要：【目的】探究不同濃度梔子苷對雙酚A（BPA）致鯉魚（Cyprinus carpio）肝毒性的影響，為魚類保肝藥物的篩選提供依據。【方法】以75條鯉魚為試驗材料，設5個處理組，即空白對照組、模型組（0.5 mg/L BPA暴露）及梔子苷處理組（BPA+梔子苷），其中，梔子苷設低（1.25 g/kg）、中（2.50 g/kg）、高（5.00 g/kg）3個濃度，養殖70 d后，檢測血清中谷丙轉氨酶（GPT）、谷草轉氨酶（GOT）、堿性磷酸酶（AKP）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的水平，肝組織中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）和總抗氧化能力（T-AOC）的水平，以及肝臟中fatp1、fas、ppar-α、nrf2、keap1、ho-1、tlr1、myd88、il-1β、il-6和il-10基因的表達量，來評價梔子苷對鯉魚肝毒性的治療效果。【結果】與對照組相比，模型組鯉魚的特定生長率顯著降低，餌料系數顯著增高（P<0.05，下同），而聯合投喂3種濃度的梔子苷可顯著提高特定生長率，降低餌料系數，改善鯉魚的生長情況。與模型組相比，飼喂中、高濃度的梔子苷顯著降低鯉魚血清中GPT、GOT和AKP活性，緩解鯉魚肝損傷的程度。飼喂低、中濃度的梔子苷顯著降低血清中TG和LDL-C的水平和肝組織中fatp1和ppar-α基因的表達量，增加血清中HDL-C的含量，改善了鯉魚肝臟脂質代謝紊亂。同時，經過3種濃度的梔子苷處理后，肝組織中SOD活性和nrf2、ho-1基因的表達量顯著升高，keap1基因的表達量顯著降低，表明梔子苷對雙酚A引起的肝臟氧化應激有緩解作用。此外，飼喂3種濃度的梔子苷較模型組顯著下調了myd88、il-1β和il-6基因的表達量，但顯著上調了il-10基因的表達，抑制了鯉魚肝臟的炎癥反應。【結論】梔子苷可不同程度緩解雙酚A引起的鯉魚肝毒性，并通過改善肝臟脂質異常代謝，增強抗氧化能力，抑制炎癥反應等，減輕鯉魚肝損傷程度。考慮到實際生產成本，推薦以中濃度（2.50 g/kg）的梔子苷作為保肝藥物的篩選依據。

關鍵詞： 梔子苷;雙酚A;保肝作用;肝毒性;鯉魚

中圖分類號： S948? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）02-0501-08

Abstract：【Objective】Explored the effects of different concentrations of geniposide on the hepatotoxicity of bisphenol A（BPA） in common carp（Cyprinus carpio）， and provided a reference for screening hepatoprotective drug in fish. 【Method】In this study， 75 common carps were divided into five treatment groups： blank control group， model group（0.5 mg/L BPA exposure） and geniposide treatment group （BPA+geniposide）. Geniposide was set at low （1.25 g/kg）， medium（2.50 g/kg） and high（5.00 g/kg） concentrations for 70 d. Then detected glutamic-pyruvic transaminase（GPT）， glutamic oxalacetic transaminase（GOT）， alkaline phosphatase（AKP）， triglycerides（TG）， total cholesterol（TC）， high-density lipoprotein cholesterol（HDL-C）， low-density lipoprotein cholesterol（LDL-C） levels in the serum， super oxide dismutase（SOD）， catalase（CAT）， glutathione（GSH）， malondialdehyde（MDA） and total antioxidant capacity（T-AOC） levels， as well as the expression levels of fatp1， fas， ppar-α， nrf2， keap1， ho-1， tlr1， myd88， il-1β， il-6 and il-10 genes in the liver to evaluate the therapeutic effects of geniposide on hepatotoxicity in common carp. 【Result】Compared with the control group， the specific growth rate of common carp in the model group was significantly reduced， and the feed coefficient was significantly increased（P<0.05， the same below）. The combined feeding of three concentrations of geniposide could significantly increase the specific growth rate， reduce the feedcoefficient， and improve the growth of carp. Compared with model group， geniposide at middleandhighconcentrations significantly reduced the activities of GPT， GOT and AKP in common carp serum， and alleviated the degree of liver injury in common carp. Lowor middle concentrations of geniposide significantly reduced the levels of TG and LDL-C in serum and the gene expressions of fatp1 and ppar-α in liver tissue， and increased the content of HDL-C in serum， which improved common carp liver lipid metabolism disorder. At the same time， after three concentrations of geniposide treatment， the activity of SOD and the gene expressions of nrf2 and ho-1 in liver tissues were significantly increased， and the expression levels of keap1 gene was significantly decreased， indicating that geniposide could relieve liver oxidative stress caused by BPA. In addition， compared with model group， feeding three concentrations of geniposide significantly down-regulated the gene expressions of myd88， il-1β and il-6， significantly up-regulated the gene expression of il-10， which inhibited the inflammatory response in liver of common carp. 【Conclusion】In summary，geniposide can alleviate common carp hepatotoxicity caused by BPA to varying degrees， and reduce hepatotoxicity by improving liver lipid metabolism， enhancing antioxidant capacity， and inhibiting inflammation. Taking into account the actual production cost， it is recommended to use geniposide at middle concentration（2.50 g/kg） as the basis for screening hepatoprotective drugs.

Key words： geniposide; bisphenol A; liver protection; hepatotoxicity; common carp

Foundation item：National Natural Science Foundation of China（31702318）; Basal Research Fund of Freshwater Fisheries Research Center， Chinese Academy of Fishery Sciences（2021JBFM09）

0 引言

【研究意義】雙酚A（Bisphenol A，BPA）是合成聚碳酸酯和環氧樹脂等的原材料，其在水環境中的分布十分廣泛（石健等，2009;Ibrahim et al.，2015）。BPA能干擾魚類的生長和發育，對其內分泌系統和免疫系統也有不利影響，給水產養殖業帶來了很大的危害（Kim et al.，2018）。肝臟是魚體最主要的代謝器官，大多數有毒物質都要經肝臟分解代謝（初曉紅等，2010）。研究表明，長期的BPA暴露對鯉魚（Cyprinus carpio）肝臟具有明顯的毒性作用，可引起氧化應激，以及脂質代謝功能異常等（莊惠生和楊光，2005;吳雪菲，2014）。因此，研發能有效緩解或治療BPA致肝毒性的藥物，對提升魚類健康水平具有重要意義。【前人研究進展】據報道，中草藥因其成分天然、毒副作用小、不易在魚體富集等優點，在水產養殖業中應用廣泛，對魚類疾病的預防及治療發揮著重大作用（Galina et al.，2009;賈睿等，2013）。梔子苷（Geniposide）又名京尼平苷，是從茜草科植物梔子（Gardenia jasminoides Ellis）的干燥成熟果實中提取的一種環烯醚萜苷類化合物，被認為是保肝利膽的良藥，且已廣泛應用于肝臟疾病的治療中（劉益華等，2012;Kim et al.，2013;代亞萍等，2019）。在對哺乳動物的研究中發現，一定濃度的梔子苷對四氯化碳（CCl4）誘導的大鼠慢性肝損傷有保護作用，可以提高受損傷肝臟的抗氧化水平，緩解肝臟的炎癥反應及纖維化（尚新濤等，2012;Chen et al.，2016）。同時，梔子苷可有效改善大鼠非酒精性脂肪肝，明顯降低大鼠血清中的游離脂肪酸水平，改善肝臟的病理表現（Ma et al.，2011;Liang et al.，2016）。另外，梔子苷能通過緩解氧化應激、調節細胞凋亡等途徑，發揮對小鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護作用（Kim et al.，2013）。【本研究切入點】目前，在水產動物中，關于梔子苷對魚類肝臟保護作用的研究幾乎未見報道。【擬解決的關鍵問題】以BPA誘導的鯉魚肝毒性模型為基礎，通過檢測相關生化指標及基因表達水平的變化，探究不同濃度梔子苷對BPA致鯉魚肝臟毒性的治療效果，為梔子苷在魚類肝病防治中的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗用鯉魚選自中國水產科學研究院淡水漁業研究中心漁場，體重為50±5 g，體表無傷，體質健康。將75條鯉魚隨機分到5個養殖箱，每個養殖箱15條魚，每天定時投喂2次基礎顆粒飼料（28%粗蛋白、11.6%粗纖維、4%粗脂肪、15%粗灰分），每日投喂量約為魚體總重的2%;暫養7 d，適應養殖環境（溶氧量>6 mg/L，pH 7.4～8.1，溫度28～32 ℃）之后開始試驗。主要試劑：梔子苷（純度≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司;BPA（純度≥99%）和二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司。

1. 2 試驗設計

根據前期研究結果，本研究以0.5 mg/L BPA作為暴露濃度（Gu et al.，2020）。基于預試驗結果及在草魚（Ctenopharyngodon idella）、小鼠和大鼠中的使用劑量（尚新濤等，2012;Sun et al. 2017），本研究選取3種不同劑量的梔子苷添加入基礎飼料中，梔子苷濃度分別為1.25、2.50和5.00 g/kg。將養殖箱中的鯉魚分為5組，分別為空白對照組、模型組（BPA）及低、中、高3個濃度的梔子苷處理組（BPA+梔子苷），每組15條魚。除空白對照組外，其余4組鯉魚均暴露在0.5 mg/L BPA中。空白對照組和模型組投喂基礎顆粒飼料，梔子苷處理組分別投喂含對應劑量梔子苷的飼料。每天定時吸取殘餌和糞便，并更換1/2養殖用水，確保水質健康及BPA濃度穩定。每7 d稱量1次各組魚的總重，并及時更新飼料投喂量。養殖70 d后停喂24 h，給所有魚稱重并記錄后，分別從每個養殖箱中隨機選取8條鯉魚，采集血液和肝臟組織進行后續分析。

1. 3 血清及肝臟組織勻漿的制備

將采集好的新鮮血液室溫放置一段時間，析出透明液體后4000 r/min離心10 min，吸取上清液（血清）備用。將100 mg肝組織用生理鹽水漂洗干凈，用濾紙吸干表面水分，放入1.5 mL的離心管中，加入9倍體積的western及IP細胞裂解液，用勻漿器進行勻漿，之后10000 r/min離心3 min，吸取上清液備用。

1. 4 生化指標檢測

谷丙轉氨酶（GPT）、谷草轉氨酶（GOT）、堿性磷酸酶（AKP）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、總抗氧化能力（T-AOC）和總蛋白（TP）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所有限公司。丙二醛（MDA）和過氧化氫酶（CAT）檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。按照試劑盒的操作說明檢測血清生化指標GOT、GPT、AKP、TG、TC、HDL-C和LDL-C，以及肝組織生化指標SOD、GSH、CAT、MDA、T-AOC和TP。

1. 5 基因轉錄水平分析

用RNAiso Plus試劑盒提取鯉魚肝臟中的總RNA，酶標儀測定OD260/280值（1.8～2.1），并計算RNA濃度。取1 μg RNA，用PrimeScriptTM RT reagent反轉錄試劑盒合成cDNA。根據TB GreenTM Premix Ex TaqTM II試劑盒的操作說明，在實時熒光定量PCR（qPCR）儀上對cDNA進行qPCR檢測。以β-actin為內參基因，根據2-ΔΔCq法（Livak and Schmittgen，2001），計算目的基因的相對表達量。上述所用試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）。目的基因的特異性引物由寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）合成，序列如表1所示。

1. 6 生長指標計算公式

特定生長率（%）=100×（lnW末?lnW初）/t

餌料系數=F/（W末?W初）

式中，W初為養殖試驗初的魚體總重（g），W末為養殖試驗末的魚體總重（g），W末為養殖試驗初的魚體均重（g），W初為養殖試驗末的魚體均重（g），t為養殖試驗天數（d），F為飼料消耗量（g）。

1. 7 統計分析

采用SPASS 19.0的單因素方差法（One-way ANOVA）進行數據分析。用LSD檢驗進行組間多重比較（P<0.05）。采用GraphPad Prism 8制圖。

2 結果與分析

2. 1 生長指標分析

試驗期間未發現魚體死亡，各組魚的存活率均為100%。魚的生長指標如表2所示，模型組的特定生長率與其他各組相比顯著降低（P<0.05，下同），餌料系數與其他各組相比顯著增加。

2. 2 不同濃度梔子苷對BPA暴露下鯉魚肝損傷指標的影響

如圖1所示，與對照組相比，模型組的鯉魚血清中GPT、GOT和AKP活性均顯著升高;聯合投喂梔子苷后，這些指標的活性均較模型組有所降低，其中，GPT和GOT的活性在中、高濃度組顯著降低，AKP的活性在中、低濃度組顯著降低。

2. 3 不同濃度梔子苷對BPA暴露下鯉魚肝臟脂質代謝相關指標的影響

如圖2所示，與對照組相比，模型組的鯉魚血清中TG、TC和LDL-C含量有所增加，其中TG含量顯著增加;聯合投喂梔子苷后，與模型組相比，上述3個指標含量均呈下降趨勢，其中TG含量在3個濃度組中均顯著降低，LDL-C含量在低濃度組顯著降低。與對照組相比，HDL-C含量在模型組顯著降低;HDL-C的含量在低、高濃度組比模型組顯著增加。

2. 4 不同濃度梔子苷對BPA暴露下鯉魚肝臟脂質代謝相關基因表達量的影響

從圖3可看出，與對照組相比，模型組的fatp1、fas和ppar-α基因表達量均有所上調，其中fatp1和fas的表達量顯著上調;與模型組相比，fatp1基因的表達量在3個梔子苷濃度組中均顯著下調，ppar-α基因的表達量在中濃度組顯著下調。

2. 5 不同濃度梔子苷對BPA暴露后鯉魚肝臟氧化應激相關指標的影響

如圖4所示，與對照組相比，模型組的SOD、GSH、CAT和T-AOC水平均顯著降低，聯合投喂梔子苷之后，上述4個指標的水平較模型組均有所提高，其中SOD活力在3個濃度組中均顯著增加，GSH的在低濃度組顯著提高。MDA的水平在模型組升高，在3個梔子苷濃度組降低，但差異均不顯著（P>0.05）。

2. 6 不同濃度梔子苷對BPA暴露后鯉魚肝臟氧化應激相關基因表達量的影響

如圖5所示，nrf2和ho-1基因的表達量在模型組比對照組顯著下調，3個梔子苷濃度組比模型組顯著上調;keap1基因的表達量在模型組比對照組顯著上調，3個梔子苷濃度組比模型組顯著下調。

2. 7 不同濃度梔子苷對BPA暴露下肝臟免疫功能的影響

從圖6可看出，與對照組相比，tlr1、myd88、il-1β和il-6基因的表達量在模型組均顯著上調，聯合投喂梔子苷后，這些基因的表達量較模型組均有所下調，其中tlr1的表達量在高濃度組下調顯著，myd88、il-1β和il-6基因的表達量在3個濃度組均顯著下調。il-10基因的表達量在模型組比對照組顯著下調，在3個梔子苷濃度組比模型組顯著上調。

3 討論

BPA是分布十分廣泛的環境雌激素，能對機體生長、發育、代謝和免疫等多個方面產生不良影響（Kim et al.，2018）。本研究中，BPA單獨暴露顯著降低了鯉魚的特定生長率，且明顯提高了投喂飼料的餌料系數（餌料系數越高，飼料轉化率越低，飼料使用效果越差）;而聯合投喂梔子苷后，3個濃度組中的特定生長率和餌料系數均恢復到正常水平（與對照組相比），表明梔子苷投喂可改善BPA引起的鯉魚生長抑制。

肝臟是魚體代謝有毒物質的關鍵器官，也最先受到許多外源性化學品的毒性影響（初曉紅等，2010;端正花等，2015）。GPT、GOT和AKP活性的變化是反映肝損傷的重要指標，一定濃度的BPA暴露可導致肝功能受損，引起血清GPT活性升高（Lee et al.，2006）。在對小鼠和斑馬魚的（Danio rerio）研究中顯示，BPA可擾亂肝臟脂質代謝，上調fatp1、fas和ppar-α等基因的表達，干擾脂肪酸的轉運、合成及代謝，以及加重肝內TG沉積（Srivastava et al.，2015;李丹婷等，2016;姚亞運，2016）。同時，BPA暴露可引起機體TC代謝出現異常，改變血清中HDL-C和LDL-C的水平（馮丹和楊嵐，2015）;BPA暴露還會產生過多的活性氧自由基（Abdel-Wahab，2014），誘導小鼠肝臟細胞發生脂質過氧化，促進MDA形成。此外，多余的活性氧自由基可消耗抗氧化酶和非酶抗氧化物質（SOD、GSH和CAT等），嚴重影響肝臟的抗氧化能力，導致氧化還原狀態失衡（Korkmaz et al.，2010;Battisti et al.，2011）。Nrf2、keap1和ho-1是調節氧化應激的關鍵基因，而BPA暴露會下調nrf2和ho-1基因的表達，上調keap1基因的表達，進一步降低小鼠肝臟的抗氧化能力（Müller et al.，2018）。有報道稱，BPA暴露會影響機體的免疫功能，誘發炎癥反應。Toll樣受體信號通路在免疫炎癥調節中發揮著重要作用（Rauta et al.，2014），BPA暴露能激活此通路，使斑馬魚胚胎中tlr3、myd88和促炎因子il-1β基因的表達上調（Xu et al.，2013），也能使小鼠心肌組織中促炎因子il-6基因的表達上調，抗炎因子il-10基因的表達下調（洪燕，2013），促進炎癥反應的發生。

本研究用0.5 mg/L的BPA對鯉魚進行70 d的暴露試驗，結果顯示，鯉魚血清中GPT、GOT和AKP活性顯著提高，說明BPA暴露引起鯉魚肝臟損傷。在BPA暴露后，肝組織中fatp1、fas和ppar-α基因的表達量也顯著上調，血清中TG含量明顯增加，HDL-C含量顯著減少，表明BPA引起鯉魚肝臟脂代謝功能發生紊亂。此外，BPA明顯降低了肝組織中SOD、CAT、GSH和T-AOC的水平，下調了nrf2和ho-1基因的表達，上調了keap1基因的表達，誘導鯉魚肝臟發生了嚴重的氧化應激反應。同時，暴露后tlr1、il-1β和il-6基因的表達量上調，il-10基因的表達量下調，說明BPA還會使鯉魚肝臟的免疫功能失調，誘發炎癥反應。

梔子苷具有保肝利膽、鎮痛抗炎及抗氧化等作用（劉益華等，2012）。研究表明，梔子苷可有效緩解由CCl4引起的小鼠肝損傷，顯著抑制血清中GPT、GOT和AKP的活性，提高肝組織中SOD、CAT和GSH等抗氧化指標的水平（尚新濤等，2012）。梔子苷還可通過對Toll樣受體通路的調節，抑制tlr2和tlr4基因的表達，提高敗血癥小鼠的抗炎能力（Kim et al.，2012）。在脂多糖誘導的大鼠巨噬細胞損傷的模型中，梔子苷的處理顯著降低了炎癥因子il-1β和il-6基因的表達量，改善了大鼠巨噬細胞的炎癥反應（Fu et al.，2012）。另外，在探究梔子苷對脂質代謝影響的研究中發現，梔子苷可降低非酒精性脂肪肝大鼠血清中TG和游離脂肪酸的含量，提高HDL-C的水平，明顯改善非酒精性脂肪肝大鼠的脂質代謝功能（林曼婷，2015）。本研究結果顯示，聯合投喂梔子苷后，與模型組相比，鯉魚血清中GPT、GOT和AKP這3種酶活性升高被抑制，表明梔子苷可緩解BPA誘導的鯉魚肝損傷。梔子苷處理組中TG、TC和LDL-C含量降低，HDL-C含量增加，肝臟中脂代謝有關基因fatp1、fas和ppar-α基因的表達量下調，表明梔子苷可改善鯉魚肝臟脂質代謝紊亂;SOD、CAT、GSH和T-AOC的水平升高，MDA含量減少，nrf2和ho-1基因的表達量上調，keap1基因的表達量下調，表明梔子苷的保肝機制與其抗氧化作用相關。同時，投喂梔子苷抑制了與炎癥相關的tlr1、myd88、il-1β和il-6基因的表達，表明梔子苷可有效抑制BPA引起的肝臟炎癥反應。

4 結論

梔子苷可不同程度緩解雙酚A引起的鯉魚肝毒性，并通過改善肝臟脂質異常代謝，增強抗氧化能力，抑制炎癥反應等，減輕鯉魚肝損傷程度。考慮到實際生產成本，推薦以中濃度（2.5 g/kg）的梔子苷作為保肝藥物的篩選依據。

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（責任編輯 鄧慧靈）