豬圓環病毒3型微滴式數字PCR檢測方法的建立與應用

李原野 陳世界 林華 張婧 安薇 陳瑛琪 張繼宗 朱玲

摘要：?為建立能靈敏、高效、準確診斷豬圓環病毒3型（PCV3）的檢測方法，并運用該方法研究PCV3傳播特性及組織嗜性，根據GenBank中PCV3 ORF2基因（MF631813.1）的核苷酸序列，設計合成PCV3的引物和探針，通過退火溫度以及引物、探針用量和特異性等優化，建立了PCV3微滴式數字PCR檢測方法。試驗結果表明建立的豬圓環病毒3型微滴式數字PCR檢測方法具有較好高的靈敏性、重復性和特異性，最低能檢測到1 μl?16.35拷貝的質粒標準品，可用于豬圓環病毒3型的早期診斷。

關鍵詞：?豬;圓環病毒3型;微滴式數字PCR

中圖分類號：?S852.65+9.2??文獻標識碼：?A??文章編號：?1000-4440（2021）02-0389-08

Abstract：?To establish a detection method that can diagnose porcine circovirus type 3 （PCV3） sensitively， efficiently and accurately and can be used to explore the transmission characteristics and tissue tropism of PCV3， the primers and probes of PCV3 were designed and synthesized according to the nucleotide sequence of PCV3 ORF2 gene （MF631813.1） in GenBank and the annealing temperature， primer and probe dosages and specificity of droplet digital PCR were optimized to establish droplet digital PCR detection method for PCV3. The results showed that， the established droplet digital PCR detection method for porcine circovirus type 3 with high sensitivity， reproducibility and specificity could detect a minimum of 16.35 copies/μl of plasmid standards. The method established in this study can be used for the early diagnosis of the porcine circovirus type 3.

Key words：?pig;circovirus type 3;droplet digital PCR

豬圓環病毒3型（Porcine circovirus type 3，PCV3）能夠引起繁殖障礙、皮炎腎病綜合征、心臟及全身多系統衰竭綜合征、淋巴組織病變以及漸行性消瘦等多種病癥[1]。目前，圓環病毒家族中的豬圓環病毒2型和豬圓環病毒3型具有致病性[2]，國內外多地區均檢測出PCV3[3]。PCV3流行廣泛，感染后發病率高，死亡率較低，因此常常伴發其他的病毒性疾病和細菌性疾病的混合感染。最近報道，在羚羊[4]、狍子[5]和蜱中檢測出PCV3[6-7]。總之，PCV3可以感染豬[8]、野豬[9]、牛、小鼠、狗和蜱等動物，有宿主廣泛性特點，這為PCV3的跨物種傳播提供了條件。因此，野生動物可能成為PCV3的潛在宿主，并對養豬業造成威脅。據報道PCV1和PCV2可以感染人體細胞[10]，而PCV3是否能夠感染人體細胞需要進一步研究。PCV3自然感染后主要攻擊豬的免疫系統，尚無特效藥物以及疫苗。因此，對PCV3的早期帶毒檢測是防控PCV3最有效的方式。

目前實驗室常用的檢測方法包括熒光定量PCR、普通PCR等都存在局限性。微滴式數字PCR（Droplet digital PCR，ddPCR）是第3代PCR技術，是一種對核酸分子進行絕對定量的方法，具有高靈敏性及準確性。該方法不依賴Ct值或內參基因，就可以確定低至單拷貝數的待檢靶分子的絕對數目[11]。該方法主要用于病原微生物分子診斷、復雜來源病原微生物的檢測和腫瘤標志因子的檢測[12]。此方法大大增加了檢測的準確性和靈敏性，有利于低病毒含量樣品的檢測以及批量早期診斷檢測。

本試驗運用建立的PCV3微滴式數字PCR檢測方法對豬臨床各樣品進行檢測，從而探究該病毒的流行情況、傳播途徑、組織嗜性，以期為PCV3的檢測提供一種更精確、高效、靈敏的方法，并為該病毒早期診斷及防控提供技術支持。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?試驗樣品?豬圓環病毒3型（PCV3）、豬圓環病毒2型（PCV2）、豬圓環病毒1型（PCV1）、豬偽狂犬病毒（Porcine pseudorabies virus，PRV）、豬藍耳病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）陽性病料、E. coli DH5α由四川農業大學動物生物技術中心提供。

1.1.2?臨床樣品的收集?238份臨床血清樣品，于2018年采自四川省綿陽市某發病豬場，該批發病豬出現疑似斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）癥狀，其中仔豬出現震顫、消瘦、皮膚黏膜蒼白等癥狀，病死后剖解發現呼吸系統病變明顯，肺部較為突出，部分死亡豬全身多處發生淋巴結水腫，收集的樣品置于-70 ℃保存。47份流產胎兒、39份公豬精液、62份唾液拭紙、53份皮膚樣品，為2017-2019年四川地區豬場送檢樣品。5頭死亡仔豬為2019年四川地區豬場送檢疑似PCV3感染仔豬，對其進行解剖，無菌采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結、腦等樣品，-70 ℃保存備用。

1.1.3?試劑與耗材?ddPCR Supermix for Probes （no DUTP）、ddPCR Droplet Generation Oil、ddPCR Droplet Reader Oil、Droplet Generator DG8 Cartndge Droplet Gene rator、DG8 Gasket Pierceable Foil Heat Seal、核酸蛋白儀均購自美國Bio-Rad公司，DL2000 DNA marker購于北京索萊寶科技有限公司，磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒（Magnetic Viral DNA/RNA Kit）、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒抽提試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司，Premix Ex Taq（Probe qPCR）、Prime Script RT reagent Kit、pMD19-T Simple Vector、Prime STAR Max DNA Polymerase、2×Taq PCR Master Mix等均購自寶生物工程（大連）有限公司，引物、探針購自生工生物工程（上海）股份有限公司，其余試劑均為國產分析純試劑。

ddPCR微滴生成儀QX100、ddPCR讀數儀QX100、ddPCR板熱封儀PX1、PCR儀、核酸蛋白測定儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2?方法

1.2.1?引物的設計與合成?根據GenBank已公開PCV3 ORF2基因核苷酸序列（MF631813.1），遵循TaqMan復合熒光引物探針設計原則，利用Primer Premier 5.0軟件設計一對特異性引物（PCV3-F1/PCV3-R1）和探針（PCV3-P），探針5′端標記熒光報告基團為FAM，3′端標記熒光淬滅集團BHQ。根據GenBank已公開PCV3 ORF2（ MF139082.1）全基因核苷酸序列，設計檢測上下游引物（PCV3-F2/PCV3-R2）。引物和探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列見表1。

1.2.2?重組質粒標準品的制備?采用特異性PCV3 ORF2檢測引物（PCV3 F2/R2）對模板進行PCR擴增，反應條件為95 ℃ 4 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環;72 ℃ 7 min。依據天根普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書進行擴增產物的回收、純化。將回收的產物連接至pMD 19-T simple Vector，轉化至DH5α感受態細胞，構建重組質粒pMD19-PCV3-ORF2。陽性克隆經上海生工生物工程技術服務有限公司測序分析，依據天根質粒抽提試劑盒明書對陽性克隆菌進行質粒抽提，測定計算出拷貝數，以陽性質粒作為PCV3 ddPCR的陽性標準品和后續試驗的陽性模板。

1.2.3?核酸提取與反轉錄?采用Magen MagPure Viral Nucleic Acid KF Kits磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒，從PCV3、PCV1、PCV2、PRV、PRRSV陽性病料、238份血清樣品、47份流產胎兒、39份公豬精液、62份唾液拭紙、53份皮膚樣品、35份疑似PCV3感染豬組織樣品中提取DNA/RNA，并移至干凈的EP管中保存。提取后的RNA使用Prime Script RTKit反轉錄試劑盒進行反轉錄。反轉錄體系為：5×PrimeScript Buffer 4.0 μl，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μl，Oligo dT Primer 1.0 μl，Random 6 mers 4.0 μl，ddH2O 4.0 μl，RNA模板6.0 μl。反應條件為37 ℃，15 min;85 ℃，5 s，并將cDNA產物保存于-20 ℃備用。

1.3?PCV3 ddPCR方法的建立

1.3.1?退火溫度的確立?選取1 μl 6.54×103拷貝的質粒標準品pMD-PCV3進行退火溫度優化試驗。擴增體系為：ddPCRTM Supermix for Probes（no dUTP）10 μl，上、下游引物各2 μl，探針1 μl，加ddH2O至20 μl。根據ddPCRTM Supermix for Probes（no dUTP）的擴增程序進行PCR擴增，擴增條件為：95 ℃ 10 min;94 ℃ 30 s，Tm 52～62 ℃，40個循環;98 ℃ 10 min，4 ℃ 2 min。進行擴增之前將PCR擴增儀的退火溫度設定為52～62 ℃，進行PCR擴增，最終根據陰、陽微滴數的比例以及熒光信號收集情況，得到最佳退火溫度，特別注意升降溫速度不得超過2 ℃/s。

1.3.2?引物用量的確立?選取1 μl 6.54×103拷貝的質粒標準品pMD-PCV3進行引物用量優化試驗。總反應體系為20.0 μl，在ddPCRTM Supermix for Probes（no dUTP）10.0 μl、模板2.0 μl、探針量1.0 μl不變的情況下，分別加入1.8 μl、1.2 μl、0.8 μl和0.4 μl的上、下游引物，剩余用ddH2O補全。在優化后的反應程序下進行反應，得出最佳引物量，使陰陽性微滴的熒光信號差異明顯。

1.3.3?探針用量的確立?選取1 μl 6.54×103拷貝的質粒標準品pMD-PCV3進行探針用量優化試驗。總反應體系為20.0 μl，在ddPCRTM Supermix for Probes（no dUTP）10.0 μl、模板2.0 μl、最優上下游引物量各1.8 μl不變的情況下，分別加入0.25 μl、0.50 μl、0.75 μl和1.00 μl的探針進行PCR擴增，剩余用ddH2O補全。確立最優的探針量，得出擴增效率最高、具有明顯陰陽性微滴熒光信號差值的最優探針量。

1.3.4?特異性試驗?分別提取PCV1、PCV2、PRV、PRRSV的核酸，以DNA或反轉錄后的cDNA為模板，運用優化的反應條件進行ddPCR擴增，驗證本方法的特異性。

1.3.5?敏感性試驗?將質粒標準品pMD-PCV3-ORF2高濃度原液進行10倍梯度稀釋，最終稀釋成1 μl 6.54×103～6.54×101拷貝，再從1 μl 65.4拷貝依次進行2倍稀釋，稀釋成1 μl 32.7拷貝、16.35拷貝、8.18拷貝共6個系列，并設置陰性對照，以這6個系列的PCV3重組質粒標準品梯度進行ddPCR，得出該方法能夠檢出的最低濃度。

1.3.6?重復性試驗?選取4個來自同一批次但濃度不同的質粒標準品pMD-PCV3-ORF2，每個濃度設置3個重復，測試批內重復性。以選出的4個濃度不同的PCV3重組質粒標準品為模板，不同時間點做3次ddPCR，測試批間的重復性，試驗過程中設置陰性對照，分析批內和批間的變異系數，驗證本方法的重復性。

1.4?臨床樣品的檢測

依據本研究所建立的ddPCR檢測方法分別對收集的238份臨床血清樣品分析本方法的有效性及符合度，對47份流產胎兒、39份公豬精液、62份唾液拭紙、53份皮膚樣品進行檢測并分析探究PCV3的傳播途徑，對35份疑似PCV3感染豬組織樣品進行檢測并探究PCV3的組織嗜性。

2?結果與分析

2.1?重組質粒pMD-PCV3-ORF2的鑒定

以PCV3的DNA，用設計的特異性引物（PCV3 F2/R2）進行PCR擴增，獲得與目的片段大小一致的擴增產物，約651 bp（圖1）。將PCR產物進行回收、連接轉化、陽性克隆增菌培養，通過PCR、酶切測序鑒定，證實成功構建重組質粒，命名為pMD-PCV3-ORF2。質粒含量經檢測計算為1 μl 6.54×1011拷貝。

2.2?PCV3 ddPCR退火溫度的優化

在設置的8個退火溫度梯度（52.0 ℃、52.7 ℃、53.9 ℃、55.8 ℃、58.1 ℃、60.0 ℃、61.2 ℃、62.0 ℃）中，均能收集到PCV3陽性微滴。從圖2可以看出當退火溫度在55.8 ℃ 時，PCR反應具有較高的FAM熒光信號值以及明顯的陰陽性熒光信號差值，因此55.8 ℃ 為最佳的退火溫度。

2.3?PCV3 ddPCR引物用量的優化

在其他反應條件不變的情況下，對4個不同上、下游引物用量（1.8 μl、1.2 μl、0.8 μl和0.4 μl）進行ddPCR反應，均收集到PCV3陽性微滴。從圖3可以看出當上、下游引物為1.8 μl時，擴增效率最高，具有較明顯的陰陽性微滴熒光信號差值，且微滴彌散度小。

2.4?PCV3 ddPCR探針用量的優化

在其他反應條件不變的情況下，對4個不同探針用量（0.25 μl、0.50 μl、0.75 μl、1.00 μl）進行ddPCR反應，均收集到PCV3陽性微滴。從圖4可以看出探針用量為1.00 μl和0.75 μl時陰陽性微滴差值明顯，但其微滴不集中。綜合考慮后選取探針用量為0.5 μl，在該探針用量時熒光信號較高，并且陰陽性微滴差值明顯，微滴彌散度低且集中。

2.5?PCV3 ddPCR的特異性

對PCV3 ddPCR檢測方法進行特異性驗證，PCV1、PCV2、PRV、PRRSV均只擴增出陰性微滴，只有PCV3擴增出陽性微滴（圖5），說明本試驗建立的PCV3 ddPCR檢測方法特異性較高。

2.6?PCV3 ddPCR的敏感性

對連續稀釋的6個系列質粒標準品進行本方法的敏感性驗證， PCV3 ddPCR方法能檢測出的最低樣品含量為1 μl 16.35拷貝，低于該含量的樣品無法檢測到陽性微滴（表2）。

2.7?PCV3 ddPCR的重復性

從表3可以看出組內以及組間試驗的變異系數都小于3%，說明所建立的PCV3微滴式數字PCR檢測方法的重復性以及穩定性較好。

2.8?PCV3 ddPCR檢測方法的運用

2.8.1?臨床樣品的檢測?238份臨床血清樣品的檢測結果顯示本研究所建立的ddPCR檢測方法可用于血清樣品的檢測，陽性檢出率為50%（119/238）。運用李曉菲等[13]建立的PCV3-MGB熒光定量PCR檢測方法（qPCR）同時對238份臨床血清樣品進行平行檢測，陽性檢出率為47.05%（112/238）（表4）。利用Kappa分析軟件對2種方法進行Kappa分析，結果顯示Kappa系數為0.941（SE=0.065，95%置信區間），說明這2種檢測方法具有良好的符合率。血清樣品的陽性率達到半數，表明目前PCV3的傳播較普遍。

2.8.2?PCV3傳播特性的探究?從表5可以看出，47份流產胎兒樣品檢出29份陽性樣品，陽性率為61.7%;62份唾液拭紙樣品檢出43份陽性樣品，陽性率為69.4%;39份精液樣品檢出27份陽性樣品，陽性率為69.2%;53份皮膚樣品檢出31份陽性樣品，陽性率為58.5%。表明本研究所建立的方法可用于臨床流產胎兒、唾液拭紙、精液、皮膚樣品的檢測。在流產胎兒和精液中也被普遍檢出，表明PCV3具有垂直傳播的特性，該種特性可能成為導致豬繁殖障礙的因素之一;在唾液拭紙中被廣泛檢出，表明PCV3可能存在于唾液中;在皮膚中被廣泛檢出，體現PCV3可存活于皮膚表面，并可能通過接觸傳播。

2.8.3?PCV3組織嗜性的探究?將送檢的5頭疑似PCV3感染癥狀的死亡仔豬分別取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、頜下淋巴結、腦樣品。樣品檢測結果（表6）顯示，病毒核酸檢出率為60%，表明本研究所建立的ddPCR檢測方法具有較高的準確性及靈敏性，且可直接檢測出目標病毒的拷貝數。5頭送檢死亡仔豬均檢測出目標病毒，其中3號、5號仔豬在各組織器官均檢測出目標病毒，表明PCV3廣泛存在于豬的各個器官中。送檢的5頭死亡仔豬各器官檢測結果顯示，在不同內臟器官中PCV3病毒核酸含量具有明顯的差異，病毒含量較高的組織器官為頜下淋巴結、肺臟、腦、腎臟、心臟，脾臟和肝臟病毒含量相對較低（圖6）。

3?討論

近年來，從PCV3檢測數據中可知PCV3并不只存在于發病豬，在健康豬中同樣存在[14]。Zhai等[3]在健康母豬和生豬屠宰樣本中檢出的PCV3陽性率分別為21.9%和19.14%，且認為PCV3可能聯合豬藍耳病病毒引起更嚴重的疾病。Saraiva等發現健康豬的PCV3陽性檢出率比發病豬高11.9%[15]。上述研究結果表明PCV3不僅存在于發病豬中，對健康豬進行早期診斷、帶毒檢測也尤為重要。目前，PCV3的實驗室診斷方法主要包括免疫組化、基于SYBR和TaqMan的qPCR[16-17]、LAMP、ELISA。ddPCR檢測技術是第3代PCR技術，具有更保守精密的檢測系統，目前該技術廣泛用于病原微生物分子診斷[18]、復雜來源病原微生物檢測、腫瘤標記因子檢測等領域。研究結果表明，ddPCR具有靈敏度極高、直接實現絕對定量、PCR反應穩定不受抑制劑影響等明顯優勢[19-20]。

PCV3 ORF2基因編碼該病毒的衣殼（Cap）蛋白質，PCV3 Cap蛋白質是病毒的主要結構蛋白。本研究針對PCV3 ORF2基因的相關保守區域設計1對特異性引物和探針，建立了豬圓環病毒3型（PCV3）ddPCR檢測方法。ddPCR最低能檢測出1 μl被稀釋到16.35拷貝的質粒標準品。運用本試驗建立的PCV3 ddPCR檢測PCV1、PCV2、PRV、PRRSV，結果均為陰性，表明該方法特異性較高，檢測結果具有可靠性。在本研究重復性試驗中，組內以及組間試驗結果的變異系數均小于3%，表明本方法的重復性好，較穩定。該方法有效減少了樣品處理各環節中的污染，降低了樣品中出現假陽性的風險。ddPCR適用于早期鑒別診斷，低病毒滴度樣本檢測。

運用建立的ddPCR檢測方法對PCV3傳播特性進行初探，發現流產胎兒ddPCR檢測陽性率為61.7%（29/47），精液為69.2%（27/39），表明該病毒可能與繁殖障礙相關，且具有垂直傳播的特性，該病毒可能是導致母豬繁殖障礙的因素之一。Ku等[21]用PCR技術在公豬精液中檢測出PCV3。Kedkovid等[22]在對38份母豬初乳樣品檢測中，發現17份樣品呈PCV3陽性，提示母豬乳液中存在PCV3，且可能發生垂直傳播。Kwon等[23]在韓國不同地區唾液拭子樣本中也檢出PCV3。表明該病毒可能潛伏存在于唾液中，最終可能通過唾液排毒進行水平傳播。Palinski等[24]在具有豬皮炎與腎病綜合征（Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）癥狀的母豬及流產胎兒體內及皮膚中檢出PCV3核酸，表明PCV3可能具有皮膚接觸傳播的特性。上述結果表明PCV3在臨床上可能通過精液傳播、唾液和皮膚的接觸傳播，能突破胎盤屏障感染胎兒，感染PCV3的豬群可以通過唾液排毒感染同居豬群，具備水平傳播和垂直傳播的可能性。

呂素芳等[25]研究發現PCV3存在于淋巴結且含量較高。Chen等[26]在PCV3與仔豬先天性震顫研究中也發現該病毒在腦中的含量較高。Qi等[27]從患有呼吸系統疾病豬采集的病料中檢測出PCV3陽性率為26.6%。Palinski等[24]也在皮炎腎病綜合征病豬體內檢測出高病毒滴度的PCV3。目前由于檢測方法不同，檢測的敏感性、準確性也存在差異，對PCV3組織嗜性的研究結果也存在差異。運用本試驗建立的ddPCR方法對5頭送檢死亡仔豬各器官共35份樣品進行檢測，結果表明，從5頭送檢死亡仔豬中均檢測到PCV3，其中有2頭死亡仔豬的不同內臟組織中均檢測出該病毒，且具有較高的病毒載量。在頜下淋巴結病毒載量最高，推測PCV3主要入侵的組織器官可能是淋巴結;其次為肺臟、腎臟、腦。該病毒在病豬體內存在廣泛，可入侵不同組織器官，且在不同的組織器官中病毒含量存在差異，感染后可能引起各器官廣泛感染最終引起全身性病毒血癥。

目前PCV3存在普遍流行與隱性感染，極大增強了該病毒的防控難度，該病毒尚未被分離出且無特效藥與疫苗，因此對該病的早期診斷、帶毒檢測、流行病學研究十分重要。常規的實驗室檢測方法，耗時長、操作復雜、易污染。本研究建立的PCV3 ddPCR檢測方法，不需要制作標準曲線，直接對樣品進行絕對定量，具有較高的敏感性、特異性、便捷性，可用于PCV3的早期診斷、帶毒監測、進出口貿易等環節，對該病的深入研究以及防控有重大意義。

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（責任編輯：張震林）