Er：YAG激光與傳統機械去齲效果的體外可行性比較

邵 鈺，尚 瓊，郭 蓉，葛米雪，周紅艷，楊顏菁,3

齲病治療目前主要依靠渦輪高低速手機去除腐質，但會產生震動、噪聲等問題。隨著微創治療中減輕患者的疼痛并取得更好的治療效果觀念的普及，微創治療的這種原則也逐漸應用于口腔臨床中。在眾多微創治療方法中，Er：YAG激光作為治療齲病的一種新技術得到了廣泛的關注。Er：YAG激光可以精準到小于1 mm的口腔區域，這使得在使用Er：YAG激光去除受感染的牙本質的同時，能夠最大限度地保留周圍健康的組織。一些研究表明，Er：YAG還可以減少去齲過程中產生過高溫度，高溫對牙髓活力可能產生不利的影響[1-2]。Er：YAG激光已經在兒童口腔科中得到了廣泛的應用[3]。盡管Er：YAG激光在口腔科領域顯示出了很大的潛力，但目前尚缺乏科學證據來闡明其在洞形制備和粘接修復中的具體作用機制。此外，一些研究發現Er：YAG激光和傳統機械方法在粘接強度、微滲漏和去齲操作時間等許多方面沒有差異。

本實驗旨在為Er：YAG激光去除齲壞和粘接修復提供更多的實驗依據。通過實驗比較Er：YAG激光和常規機械方法制備窩洞的微拉伸強度和微滲漏深度，并通過掃描電子顯微鏡(SEM)觀察兩種方法制備的牙面，從組織學的角度評價這兩種牙本質去除方法的治療效果并測定各自的去齲時間。

1 材料與方法

1.1 離體牙收集

經南京醫科大學附屬口腔醫院倫理委員會批準(批準號：PJ-2017-033-001)并經患者同意，本研究收集因牙周病變或阻生而新鮮拔除的人恒磨牙36顆，其牙合面有達牙本質深層的齲壞，為Ⅴ類洞。同時經放射學檢查，排除靜止齲、繼發齲和已露髓的牙齒。去除牙齒周圍的軟組織并清除牙菌斑和根面牙石[4]。所有離體牙在4 ℃的生理鹽水中保存，并在1周內使用。36顆離體牙隨機編號為1～36。

1.2 樣品制備和分組

用低速切割機(Isomet，美國)將離體牙的每個齲損切成大小大致相等的兩半(圖1)，分成A、B兩個樣本，A樣本納入對照組，B樣本納入實驗組[2]。實驗組按照 Er：YAG激光治療儀(Fotona M002-3A/4，德國)的臨床操作規程進行去齲，并采取以下措施：①操作者和助手佩戴護目鏡；②實驗參數設置為切割牙釉質，300 mJ，30 Hz；切割牙本質，200 mJ，20 Hz；③進行光纖頭距齲壞部位1 mm的非接觸掃描照射；④評估和再次照射，直至所有齲壞被清除。對照組采用高速手機去除無基釉以及釉牙本質交界處的腐質，然后用低速手機徹底去除腐質，達到去除軟化著色牙本質的標準。

離體牙根據齲洞被均勻地切成兩半

1.3 微拉伸粘接強度測試

編號為1～13的牙齒，用于測試微拉伸粘接強度(mTBS)。用Er：YAG激光去除齲壞組織或用手機去腐，直到肉眼和探診檢查都認為去盡腐質。所有的工作由同一個研究人員完成。沖洗和干燥后，用自酸蝕粘接劑(3M Adper Easy One，美國)處理窩洞，并用通用納米樹脂(FiltekTMZ350XT，美國)修復。充填后置于37 ℃生理鹽水中24 h。將牙冠分離后，用低速切割機(Isomet，美國)將牙本質-樹脂粘接面(窩洞側壁)制成1 mm×1 mm的啞鈴形試件(圖2)。每個樣本可制備2～4個實驗試件。用502膠粘劑(氰基丙烯酸酯粘合劑)將試件固定到微拉伸測力儀上(BISCO，美國)，并施加拉應力，直到斷裂。然后測量拉伸斷口的載荷數值(N)，并用游標卡尺測量斷面的邊長。mTBS(MPa)=試樣拉斷時的載荷(N)/斷面處截面積(mm2)。測試重復3次，計算平均值。

圖2 將試件固定在測試夾具上進行微拉伸粘接強度測試Fig.2 Test pieces fixed on the test fixture for the microtensile bond strength test

1.4 微滲漏測試

編號為14～26的牙齒用于測試微滲漏深度。從去齲到修復的操作程序與微拉伸粘接強度試驗中的操作程序相同。樣品保存在37 ℃的生理鹽水中。隨后，樣品置于5 ℃和55 ℃的冷熱循環儀(Will，中國)中進行實驗，每次浸泡30 s，交替5 000次。在距離粘接邊緣1 mm處涂3層無色指甲油，以防止正常牙齒染色。標本在1%堿性品紅中浸泡24 h后，切成1 mm厚的切片，體視顯微鏡(Nikon，日本)20倍下觀察，并測量染料滲透深度(最深處至界面的垂直距離)。

1.5 組織學評價

編號為27～32的牙齒用于組織學觀察。實驗組和對照組各6個樣本，去齲方法與前述方法相同。截去牙根，在4%多聚甲醛溶液中固定48 h，10%硝酸脫鈣、脫水后石蠟包埋，全自動半薄輪轉切片機切片，厚度4 μm樣本各制20張切片。從所有標本中隨機抽取8張切片，HE染色。HE染色步驟：樣品依次用二甲苯Ⅰ和Ⅱ以及100%、95%、80%和75%乙醇脫蠟，然后用蘇木精和伊紅染色，并以乙醇的升序(75%、80%、95%和100%)脫水。最后，每張切片用中性樹膠封住，在正置熒光顯微鏡(LEICA，德國)200倍視野下進行形態學檢查。在窩洞底部中央連續觀察6個視野。牙本質小管被染成藍紫色的部分，是殘留的細菌以及碎屑，記為“感染”的牙本質小管，統計6個視野內感染牙本質小管的數量，評分如下，0：無感染牙本質小管；1：1～10個感染牙本質小管；2：10～20個感染牙本質小管；3：20個以上感染牙本質小管。

1.6 掃描電子顯微鏡評價

取編號為33～36的牙齒，用掃描電子顯微鏡觀察牙本質表面形態。用Er：YAG激光(n=4)和傳統器械(n=4)進行去齲。將標本制成大小相同(4.0 mm×4.0 mm×2.5 mm)的牙體組織塊，并對其底部進行拋光處理。然后將其浸泡在2.5%戊二醛溶液中固定。經50%、70%、80%、90%和100%乙醇梯度脫水后，用HELIOS NanoLab 600i電子顯微鏡進行表面形貌觀察。使用掃描電子顯微鏡在兩個放大倍數下進行分析：2 000倍和3 500倍。

1.7 去齲時間

記錄前4部分實驗中實驗組和對照組的去齲時間，以開始去腐為始，以明確達到臨床腐質去盡標準為終，計算平均去齲時間并進行分析。

1.8 統計學方法

使用SPSS 22.0進行統計分析。用配對樣本t檢驗對實驗組和對照組的mTBS、微滲漏深度、組織學實驗和去齲時間等數據進行統計學分析。在所有的檢驗中，P<0.05被認為有統計學意義。

2 結 果

2.1 微拉伸粘接強度

兩個實驗組的平均mTBS值和標準差如表1所示，實驗組比對照組有更好的微拉伸粘接強度。

表1 對照組和實驗組的微拉伸粘接強度

2.2 微滲漏深度

用體視顯微鏡在放大20倍的視野下觀察切片中染料的滲透深度如圖3所示。兩組的平均微滲漏深度如表2所示，雖然實驗組的平均微滲漏深度低于對照組，但差異無統計學意義(P=0.059)。

A：對照組的部分；B：實驗組的部分

P>0.05

2.3 組織學分析

牙本質小管染色視野如圖4所示。傳統機械治療的洞底光滑、平整、連續，而Er：YAG激光去齲的洞底粗糙、熔化、凹凸不平。感染牙本質染色分析結果如表3所示。兩組間感染牙本質評分差異有統計學意義(P=0.007)。

A：對照組組織切片( ×200)顯示牙本質小管大量破壞和細菌阻塞，腔底光滑連續；B：實驗組組織切片( ×200)顯示牙本質小管少量破壞，細菌殘留較少，腔底不規則粗糙

2.4 掃描電鏡結果

掃描電鏡觀察結果如圖5所示。對照組牙本質表面形成一層厚厚的玷污層，牙本質小管結構不清、數量少、管腔栓塞。相反，實驗組的牙本質表面無玷污層且高低起伏呈魚鱗狀，牙本質小管開口清晰，管內未見栓塞。

表3 對照組和實驗組感染牙本質評分

A1和A2：對照組牙本質表面形態(A1： ×2 000；A2： ×3 500)，洞形表面不規則，有玷污層，少數牙本質小管開放；B1和B2：實驗組牙本質表面形態(B1： ×2 000；B2： ×3 500)呈層次化鱗片狀，有大量開放的牙本質小管

2.5 去齲所需時間

表4顯示了Er：YAG激光和傳統機械法的平均去齲時間。實驗組去齲所需的時間明顯長于對照組(P<0.05)。

表4 對照組和實驗組的去齲時間Tab.4 Duration of caries removal of the control and study groups

3 討 論

齲病是世界上最常見的口腔疾病，在成人和兒童中有很高的患病率[5-6]。傳統的去除齲壞的方法依賴于渦輪手機[6]。這種廣泛使用的方法快速方便，但會產生震動和聲音，從而引起許多患者(特別是兒童)的焦慮和不適。此外，這種依賴于觸覺和光學標準去除齲壞的機械方法存在過度去除健康牙齒或遺留齲壞組織的可能，這兩種結果都會導致牙髓損傷或感染[7]。近年來，微創的概念在口腔科，特別是兒童口腔科得到了發展，它側重于減輕患者的疼痛并取得更好的效果。遵循微創牙科的原則，相繼提出了多種可選擇的非侵入性方法，包括激光去齲法、非創傷性修復治療(ART)、新型聚合物切割器械(塑料和陶瓷切割器械)、氣磨法、聲波法和化學機械法等[8-9]。

傳統的機械方法在除齲過程中會產生噪聲和震動，給患者尤其是兒童帶來不適和恐懼，解決這些不足迫切需要新技術的出現[10]。在齲病治療中引入和應用Er：YAG激光可作為傳統手機的一種新的替代措施。1964年，Goldman首次將激光應用于治療齲齒[11]。1997年，在獲得美國食品和藥物管理局(FDA)的批準后，口腔科引入了Er：YAG激光，用于去除齲壞和制備洞形[10]。Er：YAG激光去除齲壞的基本作用機制是它對齲壞牙釉質和牙本質中水分子的熱效應。水和羥基磷灰石的吸收峰與Er：YAG激光的2 940 nm波長重合，將吸收大量的激光能量而產生熱,溫度迅速升高，汽化，進而產生微爆炸使牙體硬組織結構破碎，達到切割硬組織的目的。由于齲齒組織比健康的牙體組織含有更多的水分，對Er：YAG激光的高吸收性，使Er：YAG激光成為了一種可選擇的去齲方法，減少波及健康的牙齒結構[1]。與傳統方法相比，Er：YAG激光具有許多不可否認的優點，如在洞形制備過程中震動和噪音小，減少了局部麻醉的使用，可以減少患者的恐懼和不適等。

充填物與牙體組織的粘接存在幾個問題，如充填材料斷裂和邊緣微滲漏等[4,12-14]。這些都是充填體臨床耐久性面臨的主要挑戰。微拉伸粘接強度和微滲漏深度是近年來研究中評價充填體粘接質量的主要指標。1995年，Pashley 等考慮到較小的粘接面積(<2 mm×2 mm)能更準確地反映實際粘接強度，提出了微拉伸粘接強度的概念。由于粘接面較小，壓力更加均勻，試件的斷裂部位主要發生在粘接面[15-16]。在本實驗中，微拉伸試件被制成啞鈴形，從而使粘接面積盡可能小，并控制在1 mm2內[17]。在目前的體外研究中，使用Er：YAG激光與傳統的機械方法相比獲得了更好的粘接強度。樹脂和牙體組織之間的微滲漏會影響邊緣封閉，并導致繼發齲、牙齒過敏、病理性牙髓改變或充填體松動等后果[12]。除了樹脂和粘接劑體系的粘接質量和聚合收縮外，微滲漏的發生還與窩洞制備過程中使用的工具有關[14,18]。在本研究中，我們認為與傳統方法相比，Er：YAG激光去齲可以減少樹脂修復技術的微滲漏，但在統計學上沒有顯著差異。我們的結果與Yaman 等的結果是一致的[19]。據報道，牙釉質和牙本質表面紋理的物理變化可能會影響微滲漏，這與Er：YAG激光的照射頻率和時間有關。較高的照射頻率和照射時間可導致牙本質熔化和重結晶[12]，從而使牙本質組織的膠原纖維融合，減少樹脂向纖維間隙和管間擴散。此外，牙本質熔化可能與Er：YAG激光束的類型、劑量或角度有關，這可能導致了微滲漏深度不同的結果。

現代理念認為去除牙本質齲是去除大部分受感染的軟化齲壞組織，以防止微生物入侵，保護牙髓活力，并為修復準備合適的窩洞[2,20]。以往的研究表明，較高頻率的Er：YAG激光(25～30 Hz)會導致受激光照射的牙本質產生裂紋、熔融等熱損傷現象，而傳統機械制備則會產生明顯的玷污層[2,21]。在目前的體外研究中，我們根據牙本質小管中細菌沉積的數量來評估去齲的效果，顯示Er：YAG激光對感染牙本質的清潔效果優于傳統機械法，對照組的組織切片中斷裂的牙本質小管融合成串珠狀，而實驗組的牙本質小管幾乎沒有阻塞和膨脹。另一個不同之處在于傳統渦輪機處理的洞底比Er：YAG激光處理的洞底部更平整。

我們通過掃描電子顯微鏡觀察到，經Er：YAG激光處理的牙本質表面微形態清晰，牙本質小管開放、清晰，與Sallam等[15]和Chiniforush等[22]的研究結果一致。關于牙本質齲的治療，玷污層的存在會使樹脂和粘接劑系統的粘接強度降低，而牙本質小管的開放則可以增強修復材料和牙體之間的粘接強度[22]。SEM結果也證實了Er：YAG激光照射組具有較高的結合強度。然而，由于本研究的局限性，在使用Er：YAG激光或傳統機械進行窩洞預備后，沒有對牙本質和樹脂之間的相互作用模式進行SEM評估。

使用Er：YAG激光去除齲壞所花費的平均時間明顯高于使用傳統機械法去除齲壞所需的平均時間。與之前的一項研究[3]是一致的。可能是因為Er：YAG激光的使用時間包括手動切換參數的時間，導致了Er：YAG激光的工作時間較長。

體外實驗結果可能不能準確反映體內的情況。因此，還需要對Er：YAG激光用于乳牙和恒牙的釉質齲和牙本質齲的窩洞制備進行進一步的研究。

4 結 論

本研究進一步證實了Er：YAG激光用于牙釉質齲和牙本質齲治療的可行性。與傳統的機械制備方法相比，Er：YAG激光的使用可提高樹脂與牙本質組織的粘接強度，減少牙本質小管中的細菌殘留，是一種高效的窩洞制備方法。此外，有效去除玷污層和隨后暴露開放的牙本質小管也是實驗組粘接強度增加的促進因素。然而，實驗組和對照組的平均微滲漏深度沒有顯著差異。同時，實驗組的去齲時間較對照組長。本研究結果為選擇Er：YAG激光去齲提高臨床治療效果提供了依據。