葉酸缺乏對L02細胞增殖、凋亡及紡錘體組裝檢查點相關蛋白表達的影響

任歡歡，楊 瑜，徐洪寶，王忠邁，程 宗，梁 猛，王春景，廖亞平

紡錘體組裝檢查點(spindle assembly checkpoint，SAC)是細胞周期調控中的眾多檢查點之一，有助于維持細胞有絲分裂期間基因組穩定性，SAC結構功能異常是導致染色體不穩定性與非整倍體的重要原因之一，Mad2、Bub1、BubR1是SAC中的關鍵組分。

葉酸是一碳代謝循環中重要的甲基供體，在DNA合成、穩定性及修復中起關鍵作用。其缺乏會導致DNA損傷、染色體和基因組不穩定等。葉酸缺乏會對損壞SAC網絡，從而致使細胞發生有絲分裂異常與非整倍性[1]，但是非整倍體發生的機制尚不明確且葉酸缺乏對SAC影響的報道較少。本研究通過探索不同濃度葉酸對L02細胞增殖、凋亡及Mad2、Bub1、BubR1 mRNA及蛋白水平的影響，并討論可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 L02細胞(武漢普諾賽細胞庫)；無葉酸RPMI-1640培養基、胎牛血清(Gibco公司)；葉酸粉末(Sigma公司)；Annexin V-FITC/PI試劑盒、細胞周期試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液、PMSF(江蘇碧云天生物有限公司)；Mad2、Bub1、BubR1抗體(美國Bethyl公司)；β-actin抗體(Cell Signaling Technology 公司)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；熒光定量PCR試劑盒(Takara公司)；Mad2、Bub1、BubR1引物(上海生工生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組及處理 將L02細胞培養于含5%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中。將細胞分為正常對照組和不同濃度葉酸組(分別給予200 nmol/L、20 nmol/L和0 nmol/L葉酸處理2周)。

1.2.2 倒置顯微鏡下觀察細胞形態 倒置顯微鏡下觀察不同濃度葉酸培養2周后的L02細胞形態。

1.2.3 CCK8法檢測細胞活性 將培養第12天的L02細胞按3.0×103個/孔接種于96孔板，各組3孔，過夜貼壁后，每孔加入10 μL CCK8試劑后置于培養箱中培養2 h，并于450 mm處檢測吸光度(OD)值。

1.2.4 細胞周期試劑盒檢測細胞周期 將培養2周的L02細胞以5×105個/mL接種于6孔板中，收集細胞；按照說明書進行PI染色，流式細胞儀上機檢測。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測細胞凋亡 將培養2周的L02細胞以5×105個/mL接種于6孔板中，收集細胞；按照說明書進行Annexin V-FITC/PI進行染色，流式細胞儀上機檢測。

1.2.6 qRT-PCR檢測Mad2、Bub1、BubR1 mRNA的表達量 收集各組細胞，TRIzol法提取細胞總RNA，按照Takara的反轉錄試劑盒合成cDNA，PCR擴增Mad2、Bub1、BubR1。根據GenBank上公布的人類Mad2、Bub1、BubR1序列，應用Primer Primer5軟件設計引物，由上海生工生物工程公司合成(見表1)。同一標本β-actin作為內參照，采用2-△△CT法進行相對定量分析。qRT-PCR的反應條件:95 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，72 ℃ 30 s，40個循環。

表1 引物序列

1.2.7 Western blotting檢測Mad2、Bub1、BubR1的蛋白表達水平 收集各組細胞，用RIPA裂解液進行裂解，BCA蛋白定量后調整蛋白濃度，取適量蛋白進行SDS-PAGE電泳。電轉到PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉室溫封閉2 h。室溫孵育一抗Mad2、Bub1和BubR1(1∶1 000稀釋)1 h，洗膜3次，室溫孵育相應二抗1 h，細洗膜3次。ECL顯色后置于凝膠成像儀中曝光，Image J進行灰度值分析。

1.3 統計學方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結果

2.1 葉酸對L02細胞形態學的影響 與正常對照組相比，20 nmol/L與0 nmol/L葉酸培養2周后，細胞體積增大、形態不規則，0 nmol/L葉酸組現象更加顯著(見圖1)。

2.2 葉酸對L02細胞增殖活性的影響 與正常對照組相比，200 nmol/L、20 nmol/L組與0 nmol/L細胞活性明顯降低(P<0.01)；與200 nmol/L相比，20 nmol/L與0 nmol/L組細胞活性明顯降低(P<0.01)(見表2)。

表2 不同濃度葉酸培養2周后對細胞增殖能力(OD450值)的影響

2.3 葉酸對L02細胞周期的影響 與正常對照組相比，200 nmol/L組細胞G1/G0期、S期均值差異無統計學意義(P>0.05)；20 nmol/L組和0 nmol/L組細胞G1/G0期明顯降低(P<0.01)、S期明顯升高(P<0.01)。與200 nmol/L相比，20 nmol/L組和0 nmol/L組細胞G1/G0期明顯降低(P<0.01)、S期明顯升高(P<0.01)。與20 nmol/L組相比，0 nmol/L組S期明顯增加、G1/G0期明顯減少(P<0.01)(見表3)。

表3 不同濃度葉酸培養2周后對細胞周期的影響

2.4 葉酸對L02細胞凋亡的影響 與正常對照組相比，200 nmol/L組細胞凋亡率差異無統計學意義(P>0.05)；20 nmol/L組細胞發生凋亡(P<0.05)，0 nmol/L組細胞明顯發生凋亡(P<0.01)。與200 nmol/L相比，20 nmol/L組細胞凋亡率差異無統計學意義(P>0.05)，0 nmol/L組凋亡率明顯增加(P<0.01)。與20 nmol/L組相比，0 nmol/L組凋亡率明顯增加(P<0.01)(見圖2、表4)。

表4 不同濃度葉酸培養2周后對細胞凋亡的影響

2.5 葉酸對L02細胞Mad2、Bub1、BubR1 mRNA的表達量的影響 與正常對照組相比，葉酸濃度為200 nmol/L時，Bub1 mRNA的表達量增加(P<0.05),Mad2和BubR1 mRNA的表達量明顯增加(P<0.01)；葉酸濃度為20 nmol/L及0 nmol/L時，Mad2、Bub1、BubR1 mRNA的表達量均明顯增加(P<0.01)(見表5)。

表5 不同濃度葉酸培養2周后對SAC相關基因表達的影響

2.6 葉酸對L02細胞Mad2、Bub1、BubR1蛋白表達的影響 與正常對照組相比，200 nmol/L組Bub1蛋白表達量增加(P<0.05)，20 nmol/L、0 nmol/L組Bub1 蛋白表達量明顯增加(P<0.01)；200 nmol/L、20 nmol/L和0 nmol/L組Mad2和 BubR1蛋白表達量均明顯增加(P<0.01)(見圖3、表6)。

表6 不同濃度葉酸培養2周后對SAC相關蛋白表達的影響

3 討論

相關實驗研究顯示[2]葉酸濃度為120 nmol/L時便可維持人淋巴細胞基因組結構穩定，因此本實驗選取略高于基因組穩定的葉酸濃度即200 nmol/L、20 nmol/L、0 nmol/L作為實驗組。CCK8結果顯示葉酸濃度為200 nmol/L、20 nmol/L、0 nmol/L時葉酸增殖受到了明顯抑制，細胞周期與凋亡結果顯示，葉酸濃度為200 nmol/L時，L02細胞G1/G0期、S期及凋亡率均值與正常對照組差異無統計學意義。葉酸濃度為20 nmol/L、0 nmol/L 細胞發生S期阻滯，凋亡數量增多，且葉酸濃度越低S期阻滯越明顯、細胞凋亡數量越多。COURTEMANCHE等[3]的研究顯示葉酸缺乏可以降低細胞增殖，誘導凋亡和細胞周期阻滯，本研究與上述研究結果相符合。LIANG等[4-5]研究表明葉酸缺乏誘導細胞發生G1/G0期阻滯，從而導致細胞發生凋亡，在G1/G0期阻滯與凋亡之間建立了聯系。HUANG等[6]研究結果顯示在葉酸缺乏的培養基中HepG2細胞葉酸濃度較低，細胞在S期積累隨后發生G2/M期阻滯，進而誘導細胞發生凋亡。低葉酸缺誘導的DNA的損傷程度具有凋亡反應，這是葉酸缺乏引起細胞凋亡的原因之一。本研究中，當葉酸濃度為20 nmol/L、0 nmol/L時細胞發生S期阻滯，進而誘導細胞發生凋亡。本研究與上述研究結果有所不同，本研究結果顯示葉酸缺乏時細胞發生S期阻滯，我們認為差生差異的原因可能是由于所用細胞系、培養細胞時間不同造成的。

SAC作為細胞周期檢查點對于維持細胞周期正常進行至關重要，Bub1參與染色體排列，Mad2和BubR1通過結合底物CDC20，阻止CDC20激活APC/C以達到抑制APC/C的效果，防止細胞提前進入后期。SAC作為細胞周期的監控機制，其某些成分的異常表達會使SAC功能發生改變，導致染色體不穩定和非整倍體。對果蠅和小鼠的研究均證實了SAC在維持染色體穩定方面的重要性[7-11]，在SAC發生突變的細胞中，有絲分裂錯誤的發生率很高，導致非整倍體細胞的比例急劇增加[11-12]。在一項宮頸癌研究中[13]發現，下調Mad2和BubR1可以促進SiHa細胞增長，增強細胞侵襲和遷移能力，抑制細胞凋亡，降低藥物治療作用[13]。并且下調Mad2可以通過調控磷酸化survivin的活化，調控胃癌細胞周期，增加增殖，提高胃癌細胞的耐藥性[14]。另一項對乳腺癌研究[15]中，與KrasG12D或Her2同時在成年小鼠乳腺中過表達有絲分裂檢查點蛋白Mad2，會導致有絲分裂檢查點過度激活，過早的Mad2表達會導致強烈的有絲分裂停止和細胞死亡增加。用特異性的小干擾RNA敲低紡錘體檢查點蛋白BubR1或Mad2，可顯著減少6,7-二甲氧基-3-(3-甲氧基苯基)異喹啉-1-胺(CWJ-082)誘導的有絲分裂細胞積累和凋亡[16]。印度的一項藥物研究[17]也顯示，過表達的Mad2通過恢復適當的后期啟動和維持更多的細胞存活，部分地挽救了藥物的有害作用。在肝細胞性癌組織和細胞中，miR-490-5p的過表達或Bub1的過表達抑制了肝細胞性癌細胞的增殖、遷移、侵襲，增加了凋亡率[18]。缺少Bub1的小鼠胚胎成纖維細胞不能使其染色體對齊或維持SAC功能[19]。本研究結果顯示，葉酸濃度為200 nmol/L、20 nmol/L和0 nmol/L時Mad2、Bub1、BubR1 mRNA的表達量明顯增加，Western blotting檢測也顯示在蛋白水平上Mad2、Bub1、BubR1表達量明顯增加。

結合上述研究和實驗結果我們得出這樣一個結論：對于SAC來說葉酸濃度為200 nmol/L已經達到一種缺乏狀態，Mad2、Bub1、BubR1的高表達用于增加SAC的活性，可以維持細胞有絲分裂進行，避免細胞發生凋亡。當葉酸極度缺乏時(20 nmol/L和0 nmol/L)，SAC功能活性受到了嚴重損害，Mad2、Bub1、BubR1的高表達不足以維持其正?；钚?，有絲分裂出現異常，可能導致非整倍體及染色體不穩定的發生，使得細胞增殖受到抑制，細胞周期發生阻滯，誘導細胞發生凋亡。綜上所述，本研究結果顯示，對于L02細胞來說葉酸濃度為200 nmol/L時已經達到一種缺乏狀態，葉酸缺乏時SAC功能異常，可能是阻礙細胞增殖、誘導凋亡的原因。