TL1A表達對炎癥性腸病相關腸纖維化的意義

楊玉宇 阮巍山 徐莉 陳東鋒

炎癥性腸病為非特異性腸道疾病，其發病機制及發病原因均未明確，具有反復發作性、慢性遷延性特征，且并發癥較多，腸纖維化即為其中較為多見的一種并發癥[1]。腸纖維化發生機制為：基于易感基因，導致腸黏膜組織出現免疫失衡，并且與腸菌抗原產生相互作用，引起炎性細胞浸潤，并且釋放出大量生長因子及炎性因子，對腸道間質細胞組織產生激活作用，形成大量膠原等細胞外間質，于腸壁內大量沉積，從而引起疾病[2,3]。腸壁纖維化需要經過較長的過程，而于炎癥性腸病的發展進程中，其腸壁纖維化臨床機制尚未明確，多認為是腸道間質細胞組織、局部細胞因子、炎性細胞組織與慢性炎癥進行相互作用后引起[4,5]。TL1A為腫瘤壞死因子家族中的一個成員，于淋巴細胞組織、骨髓細胞組織中均有表達，能增加腸道趨化因子C-C家族趨化因子受體9(C-C chemokine receptor 9,CCR9)與受體CCR10，導致Foxp3+調節性T細胞組織數量增多，不僅會使輔助性T細胞1活性增加，而且持續高表達還可能對黏膜組織炎性反應產生促進作用，并且引起腸壁纖維化[6,7]。為分析TL1A表達對炎癥性腸病相關腸纖維化的意義，本次以右旋葡聚糖硫酸鈉誘導建立的炎癥性腸病相關腸纖維化小鼠模型為對象展開研究，以期為炎癥性腸病、腸纖維化臨床治療工作的展開提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 C57BL/6野生型小鼠，9～12周，平均(10.61±0.17)周；體重20～24 g，平均(22.50±0.19)g；清潔級，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證編號：11400700208619；淋系細胞高表達TL1A轉基因型小鼠，8～12周，平均(10.57±0.20)周；體重19～25 g，平均(22.61±0.23)g；清潔級，種鼠為美國Cedars-Sinai醫學中心IBD 與免疫生物學研究中心提供，經我方飼養及繁殖后進行篩選、鑒定。此次試驗嚴格參照《中華人民共和國實驗動物管理條例》中的規定流程展開，且符合倫理要求。

1.2 實驗儀器 凝膠成像分析儀購于江蘇金壇市宏華儀器(MmlIT IMAGE型)，光鏡顯微照相器購于日本株式會社尼康，組織切片機購于德國徠卡(HM-315型)，高速臺式離心機購于德國Hettich ENTRIFVGEN(UNIVERSAL-16R型)，脫色搖床購于江蘇麒麟醫用器械廠(TS-1型)，Image-Pro plus V.6.0 圖像分析軟件購于Media Cybernetics公司。

1.3 實驗試劑 右旋葡聚糖硫酸購于MP Biomedicals，乙二胺四乙酸購于華美生物工程公司，氫氧化鈉購于河南海韻環保科技有限公司，三(羥甲基)氨基甲烷購于上海化學試劑公司，脫氧核糖核苷三磷酸購于上海兆維科技發展有限公司，taq酶購于上海桑尼生物科技有限公司，瓊脂糖凝膠購于Spain Oxoid，碘伏購于天津永大試劑有限公司，磷酸緩沖鹽溶液購于南京森貝伽生物科技有限公司，4%多聚甲醛購于北京索萊寶科技有限公司，二甲苯購于武漢欣欣佳麗生物科技有限公司，梯度乙醇購于北京諾博萊德科技有限公司，酸性麗春紅品紅染色液購于百奧萊博，1%磷鉬酸購于北京雷根生物技術有限公司，2%苯胺藍購于上海榕柏生物技術有限公司，中性樹膠購于上海恪敏生物科技有限公司，天青石藍購于上海經科化學科技有限公司，天狼星紅飽和苦昧酸染液購于北京吉美生物技術有限公司，枸櫞酸鹽緩沖液購于上海經科化學科技有限公司，過氧化氫購于廣東恒健制藥有限公司，山羊血清封閉液購于北京康為世紀生物科技有限公司，生物素化二抗工作液購于深圳欣博盛生物科技有限公司，辣根酶標記鏈霉卵白素工作液購于武漢純度生物科技有限公司，二氨基聯苯胺購于蘇州亞科科技股份有限公司，1%鹽酸乙醇購于上海榕柏生物技術有限公司，1%氨水購于上海滬震實業有限公司。其他試劑為國產或者進口分析純。

1.4 方法

1.4.1 轉基因小鼠鑒定方法:C56BL/6野生小鼠與基因型小鼠進行交配，于小鼠達到3周齡，取尾尖5 mm，放置于Eppendorf(EP)管內，將500 mmol/L乙二胺四乙酸(pH值=8)及25 mmol/L氫氧化鈉混合液共150 μl 加入其中，予以95℃水浴，約30 min后，將40 mmol/L三(羥甲基)氨基甲烷(pH值=6)共150 μl加入其中，予以渦旋震蕩，5 min后行12 000 r/min×8 min離心，取上清液置入新EP管，予以聚合酶鏈式反應檢測，反應體系：5×聚合酶鏈式反應緩沖液3 μl，2 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸1 μl，待測DNA 3 μl，10 mmol/L上游引物5’-GACTAACAAAGATGCCTGCCTGTGG-3’1 μl，10 mmol/L下游引物5’-GCCATCCTTCTGCTGTCTTGGAGA-3’1 μl，蒸餾水38 μl，taq酶0.5 μl。反應條件：94℃ 3 min及45 s，56℃ 30 s，72℃ 45 s及4 min，4℃ 10 min，反應時，2～4步重復進行24個循環。待反應完成后，提取聚合酶鏈式反應產物5 μl 及16×上樣緩沖液1 μl，予以混合，以瓊脂糖凝膠(1.5%)電泳，再用凝膠成像分析儀進行鑒定，LCK-TL1A目的基因的位置是192 bp。

1.4.2 小鼠模型建立方法與分組方法:以右旋葡聚糖硫酸鈉誘導建立炎癥性腸病相關腸纖維化小鼠模型，采取隨機法將C56BL/6野生小鼠及基因型小鼠隨機分作研究組與對照組，每組10只。對照組予以飲用蒸餾水，研究組予以間斷性飲用2%右旋葡聚糖硫酸鈉水，共4周。研究組右旋葡聚糖硫酸鈉水飲用時間為：d1～5，d8～12，d15～19，d22～26，其余時間均飲用蒸餾水。

1.4.3 小鼠取材:給予小鼠麻醉，首先碘伏消毒，將皮膚組織切開后進入至腹腔，對末端回腸進行迅速分離處理，至直腸止。以4℃磷酸緩沖鹽溶液將其沖洗3次后，取腸組織3 cm，用以提取細胞組織，再取腸組織5 mm，以4%多聚甲醛予以固定12～24 h后，進行石蠟包埋切片，并對腸系膜淋巴結組織、脾臟進行分離。

1.4.4 檢測方法:①以Masson(MT)染色與天狼猩紅染色法定量分析腸組織纖維化程度。AMT染色法。對包埋結腸組織連續切片，厚度控制4 μm，再予以染色：二甲苯脫蠟后，梯度乙醇持續脫蠟至水，以自來水進行1 min沖洗，蘇木精4 min后，水洗，酸性麗春紅品紅染色液10 min后，水洗，1%磷鉬酸3 min后，2%苯胺藍1 min，再0.2%冰醋酸片刻，并以梯度乙醇進行脫水，用二甲苯透明處理，中性樹膠進行封片。于光鏡鏡頭下對腸組織纖維化程度進行觀察，倍數選擇200×，再以Image-Pro plus V.6.0 圖像分析軟件展開定量分析。B天狼猩紅(Picrosirius Red )染色法。對包埋結腸組織連續切片，厚度控制4 μm，再予以染色：二甲苯脫蠟后，梯度乙醇持續脫蠟至水，以自來水進行1 min沖洗，天青石藍5 min后，以蒸餾水沖洗，予以天狼星紅飽和苦昧酸染液10 min，再用蒸餾水沖洗，并以梯度乙醇進行脫水，用二甲苯透明處理，中性樹膠進行封片。結果定量分析方法與MT染色同。②以免疫組織化學法對結腸組織內Ⅰ、Ⅲ型膠原、TGF-β1及Smad3表達進行測定。對包埋結腸組織連續切片，厚度控制3 μm，再予以染色：二甲苯脫蠟后，梯度乙醇持續脫蠟至水，以蒸餾水進行1 min沖洗，用枸櫞酸鹽緩沖液進行高壓修復，過氧化氫15 min后，磷酸緩沖鹽溶液3次×3 min，山羊血清封閉液20 min后，予以一抗過夜，磷酸緩沖鹽溶液3次×3 min，生物素化二抗工作液，磷酸緩沖鹽溶液3次×3 min，辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，磷酸緩沖鹽溶液3次×3 min，二氨基聯苯胺顯色，蘇木精染色約5 min后，水洗，1%鹽酸乙醇持續2 s，自來水進行1 min沖洗，1%氨水持續30 s，自來水進行1 min沖洗，并以梯度乙醇進行脫水，用二甲苯透明處理，中性樹膠進行封片。于光鏡鏡頭下對腸組織中的陽性表達情況進行觀察，依據抗體指標不同效價選擇相應的稀釋比例，Ⅰ、Ⅲ型膠原稀釋比例均是1∶50，TGF-β1及Smad3均為1∶100。選擇磷酸緩沖鹽溶液替代一抗展開以上染色步驟，倍數選擇200×，再以Image-Pro plus V.6.0圖像分析軟件展開定量分析。

2 結果

2.1 轉基因小鼠鑒定結果 以LCK-CD2-TL1A-GFP引物序列對小鼠DNA進行測定，于192 bp處，野生小鼠無目的基因檢出，而轉基因小鼠則可見目的基因成像，以此可鑒定出轉基因小鼠。見圖1。

圖1 轉基因小鼠鑒定結果圖

2.2 TL1A表達對炎癥性腸病小鼠結腸膠原的作用 健康結腸黏膜組織中有少量膠原蛋白沉積，予以MT染色后，呈現出輕微藍色；予以天狼猩紅染色后，呈現出紅色，且于纖維化進程中，黏膜組織及黏膜組織下層膠原蛋白的沉積量逐漸增加，染色程度、染色面積也隨之增加。通過軟件分析，其累積陽性光密度值表明，野生小鼠中，研究組結腸纖維化程度加重比對照組更高；轉基因小鼠中，研究組結腸纖維化程度加重同樣比對照組更高，且轉基因小鼠結腸纖維化程度比野生小鼠高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1，圖2。

表1 不同染色后小鼠結腸纖維化程度比較

2.3 小鼠結腸組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原表達 免疫組織化學染色后，發現胞漿呈現出棕色顆粒陽性表達，通過軟件分析，其累積陽性光密度值表明，野生小鼠中，研究組小鼠的Ⅰ、Ⅲ型膠原表達均比對照組高；轉基因小鼠中，研究組小鼠的Ⅰ、Ⅲ型膠原表達比對照組更高，且轉基因小鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原表達比野生小鼠高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3，表2。

表2 小鼠結腸組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原表達比較

2.4 小鼠結腸組織中TGF-β1及Smad3表達 通過Image-Pro plus V.6.0軟件分析，其累積陽性光密度值表明，野生小鼠中，研究組小鼠的TGF-β1及Smad3表達均比對照組高，差異有統計學意義(P<0.01)；轉基因小鼠中，研究組小鼠的TGF-β1及Smad3表達同樣比對照組更高(P<0.01)，且轉基因小鼠結腸組織中TGF-β1及Smad3表達比野生小鼠高，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖4，表3。

表3 小鼠結腸組織中TGF-β1及Smad3表達比較

3 討論

腸道成纖維細胞在腸道纖維化進程中發揮重要作用，為其效應細胞，腸道成纖維細胞效應變化、活化過程中，TGF-β/Smads信號傳導均起著重要作用[8]。研究表明，腸道炎癥的發生以及進展中，Ⅰ、Ⅲ型膠原沉積以及TGF-β1表達均會上調，并且伴隨著Smad3表達上調[9]。炎癥性腸病的一種易感基因即為TL1A，TL1A及受體均會對腸黏膜T細胞組織增殖與活化產生影響，并對Th細胞極化進行誘導，促使腸黏膜免疫系統的耐受機制出現紊亂，引起炎癥性腸病[10]。腸纖維化出現的首要因素之一即慢性炎性反應，且慢性炎性反應還會對腸成纖維細胞組織活化產生激活作用，導致大量細胞外間質形成，引起腸纖維化[11]。

Sebastian Zundler等[12]研究表明，炎癥性腸病患者腸黏膜免疫反應存在失調問題，以炎性細胞浸潤為主要表現，不僅會釋放出炎性細胞因子，而且還會使結腸黏膜組織受損，從而導致腸道出現慢性炎癥。在炎性細胞因子受損因素作用下，炎癥性腸病患者腸道長時間維持修復與受損并存狀態中，易引起嚴重性并發癥，例如腸纖維化、腸梗阻以及腸道腸狹窄等，需及時進行專業治療，以促進疾病轉歸[13]。纖維化進程中的細胞外間質即Ⅰ、Ⅲ型膠原，來源于成纖維細胞組織的合成，于腸道中大量分泌及沉積[14]。

本次實驗通過右旋葡聚糖硫酸鈉誘導建立炎癥性腸病相關腸纖維化小鼠模型，并予以MT染色以及天狼猩紅染色，以評定炎癥性腸病相關腸纖維化小鼠腸道膠原纖維組織的變化情況，結果發現C56BL/6野生小鼠及轉基因小鼠經間斷性飲用2%右旋葡聚糖硫酸鈉水后，其結腸纖維化程度加重均比飲用蒸餾水的小鼠更高，并且轉基因小鼠結腸纖維化程度加重比野生小鼠高，同時免疫組織化學染色后發現轉基因小鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原表達比野生小鼠高，轉基因小鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原表達比野生小鼠高，表明炎癥性腸病相關腸纖維化小鼠結腸出現炎性改變，黏膜組織及其下層存在膠原蛋白成分沉積，導致膠原染色面積異常增加。不僅如此，轉基因小鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原沉積量還明顯高于野生小鼠，可見炎癥性腸病相關腸纖維化小鼠不僅存在結腸炎癥，而且還會有膠原合成量增加、過度沉積等情況出現。

TGF-β1為促纖維化因子之一，來源于T細胞組織、腸道上皮細胞組織、成纖維細胞組織的分泌及合成，且于上述細胞中均可表達，健康的結腸組織中，TGF-β1及Smad3表達較少，當腸組織被破壞，則于腸道各層中均有表達，以免疫組織化學染色法進行檢測，可發現細胞膜組織以及細胞漿中均有棕色顆粒出現[15,16]。Jie等[17]研究發現，TGF-β1于生理狀態中時無活性，若被活化，可表現出促進組織修復、對細胞分化進行調節、使腸道屏障加強、對細胞增殖進行抑制等功效。處于炎癥初期階段時，TGF-β1存在抗炎功效，隨著炎癥加重與進展，TGF-β1調節功能、分泌量均會出現變化，以促炎作用、促纖維化作用為主要表現[18,19]。TGF-β1促腸纖維化的途徑是介導Smads信號，已成為腸纖維化關鍵性因子之一[20]。本次實驗結果發現，轉基因小鼠結腸組織中TGF-β1及Smad3表達比野生小鼠高，差異有統計學意義(P<0.05)，表明炎癥性腸病相關長纖維化發生與腸道炎性癥狀發生呈現出正相關關系。

綜上所述，TL1A對腸成纖維細胞組織活化及增殖起著促進作用，通過促使Ⅰ、Ⅲ型膠原大量合成，使炎癥性腸病相關腸纖維化的程度加重，同時TL1A還能使炎癥性腸病相關腸纖維化進一步發展，TL1A表達對炎癥性腸病相關腸纖維化的作用機制之一即促進TGF-β1及Smad3表達上調。