血清miR-224-3p和miR-4669水平在結腸癌診斷和預后中的臨床價值

陳國雁 馮曉波 尚精娟 李敏虹 廖冰靈

結腸癌是普外科常見腫瘤，其發(fā)病率呈逐年增高的趨勢，其治療主要為手術治療。結腸癌早期患者手術治療預后較好，而晚期患者預后較差，故早期發(fā)現(xiàn)結腸癌是提高預后的重要因素[1,2]。現(xiàn)有對結腸癌的診斷主要依靠臨床癥狀和體征，并依據(jù)CT和胃腸鏡檢查等確診，往往發(fā)現(xiàn)結腸癌屬于晚期，對預后產生較大的影響[3]。因此，學者們仍在尋找能夠早發(fā)現(xiàn)和早診斷的方法，其中微小RNA(miRNA)在腫瘤的早期診斷方面具有一定的臨床價值[4]，是一類非編碼的RNA，在轉錄水平對人體的生理過程起到重要的調控作用，最新的研究證實miRNA具有癌基因和抑癌基因類似的作用，并且在腫瘤診斷方面具有一定的臨床價值[5]。本組通過檢測結腸癌患者血清miR-224-3p和miR-4669的表達，觀察其在結腸癌診斷和預后中的臨床意義，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年1月至2016年12月在我院確診結腸癌的患者116例，為結腸癌組。其中男75例，女41例；年齡46～79歲，平均年齡(61.38±9.64)歲，TNM分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期31例，Ⅲ期36例，Ⅳ期31例。淋巴結轉移陽性68例，陰性48例。選擇同期在我院行腸息肉治療的患者75例，為結腸息肉組，其中男45例，女30例；年齡42～79歲，平均年齡(62.27±10)歲；同期在我院行健康體檢者45例為健康對照組，男29例，女16例；年齡38～79歲，平均年齡(61.95±7.28)歲。3組年齡和性別比等基線資料差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入與排除標準 (1)納入標準：患者均知情同意，簽署知情同意書，經醫(yī)院倫理委員會審核通過；結腸癌組和結腸息肉組均行病理確認。(2)排除標準：其他類型的腫瘤；血液系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)疾病；依從性差或者智力障礙者；心肝腎等重要臟器功能不全者。

1.3 方法

1.3.1 血清標本留取和指標的檢測：患者入院時和手術后1周抽取肘靜脈血10 ml。血液標本采用離心機將血液離心，離心半徑15 cm，離心速度3 000 r/min，離心15 min，抽取上清液放置在除酶管內，放置在-70℃冰箱中。血清CEA水平采用酶聯(lián)免疫反應檢測。

1.3.2 qRT-PCR:總RNA的提取：現(xiàn)血清200 μl中加入1 000 μl的溶解試劑，靜置在室溫下15 min，并根據(jù)試劑盒說明書提取血清中的中RNA，并用DEPC溶解總RNA。通過試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，根據(jù)試劑盒One Step Prime Script miRNA cDNA Synthesis Kit，將PCR參數(shù)設定為：37℃ 60 min，85℃ 5 s。RT-PCR：根據(jù)使用說明書配制20 μl的RT-PCR反應體系，并根據(jù)熒光定量PCR儀進行PCR的擴增。PCR引物的合成，根據(jù)設計軟件primer express 3.0合成qPCR檢測引物探針。miR-224-3p的引物上游引物：5’-GGTCCAAATGGTGCCCTAGTG-3’；下游引物5’-GGTCCAAAATGGTGCCCTAGTGAC-3’；miR-4669上游引物：5’-ATGCCTCCCTTCACTTCCTG-3’；下游引物5’-TTATGCCCTCCTCCACTTCC-3’；U6的上游引物：5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’；下游引物5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。根據(jù)試劑盒說明書，設計反應條件：95℃進行15 min的預變性，循環(huán)參數(shù)設置為94℃變性15 min，在55℃退火30 s，并在72℃延伸30 s，總共反應40個循環(huán)，根據(jù)溶解曲線設置熒光信號采集穩(wěn)定75℃。以U6為內參，結果以2-ΔΔCT來表示表達相對值，其中ΔΔCt=(CT實驗組目的基因-CT實驗組U6)-(CT對照組目的基因-CT對照組U6)。

1.4 觀察指標 觀察3組血清miR-224-3p、miR-4669和CEA水平的變化，血清miR-224-3p和miR-4669表達，在診斷結腸癌，與臨床指標的關系，及其在診斷3年內出現(xiàn)死亡的關系。

2 結果

2.1 3組血清miR-224-3p、miR-4669和CEA水平的變化 結腸癌組術前血清miR-224-3p和CEA水平高于結腸息肉組和健康對照組(P<0.01)，而結腸息肉組明顯高于健康對照組(P<0.01)，結腸癌患者手術后血清miR-224-3p和CEA水平較治療前明顯降低(P<0.01)；結腸癌組血清miR-4669水平明顯低于結腸息肉組和健康對照組(P<0.01)，結腸息肉組明顯低于健康對照組(P<0.01)，手術后結腸癌患者血清miR-4669水平較術前明顯提高(P<0.01)。見表1。

表1 3組血清miR-224-3p、miR-4669和CEA水平的變化

2.2 血清miR-224-3p和miR-4669表達在診斷結腸癌中的效能 血清miR-224-3p和miR-4669表達具有較高的靈敏度和特異性，其曲線面積(AUC)明顯高于CEA(P<0.05)，將miR-224-3p和miR-4669兩個指標進行二元回歸Logistics分析的方程1.72×XmiR-224-3p-2.36×XmiR-4669+2.98，聯(lián)合檢測(miR-224-3p+miR-4669)的靈敏度為94.8%，特異性為89.3%，其AUC為0.962，明顯高于單個指標miR-224-3p(Z=3.889，P<0.01)和miR-4669(Z=2.264，P<0.05)，而miR-4669和miR-224-3p的AUC比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2，圖1。

表2 血清miR-224-3p和miR-4669表達在診斷結腸癌中的效能

圖1 血清miR-224-3p和miR-4669表達在診斷結腸癌中的效能

2.3 血清miR-224-3p和miR-4669表達與臨床指標的關系 血清miR-224-3p和miR-4669表達水平與浸潤深度、淋巴轉移、血管浸潤、TNM分期和分化程度具有明顯相關性(P<0.01)，與年齡、性別、腫瘤部位和病理分型無明顯相關性(P<0.01)。見表3。

表3 血清miR-224-3p和miR-4669表達與臨床指標的關系

2.4 血清miR-224-3p和miR-4669表達與3年內出現(xiàn)死亡的相關性 結腸癌患者死亡組血清miR-224-3p表達水平明顯高于存活組(P<0.01)，血清miR-4669表達死亡組明顯低于存活組(P<0.01)。見表4。

表4 血清miR-224-3p和miR-4669表達與3年內出現(xiàn)死亡的相關性

2.5 血清miR-224-3p和miR-4669表達在預測3年內出現(xiàn)死亡的效能 血清miR-224-3p和miR-4669表達在診斷3年內出現(xiàn)結腸癌死亡具有較高的靈敏度和特異性，兩指標進行二元方程回歸得方程1.72×XmiR-224-2.36×XmiR-4669+2.98，聯(lián)合檢測的靈敏度為86.0%，特異性為90.4%，AUC為0.945明顯高于單個指標miR-224-3p(Z=2.656，P<0.01)和miR-4669(Z=3.502，P<0.01)的AUC，而兩者miR-224-3p和miR-4669間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5，圖2。

圖2 血清miR-224-3p和miR-4669表達預測2年內結腸癌患者出現(xiàn)死亡的靈敏度和特異性

表5 血清miR-224-3p和miR-4669表達在診斷結腸癌出現(xiàn)3年內死亡的效能

3 討論

早期結腸癌手術后預后較好，晚期結腸癌預后較差，故結腸癌若能夠早期診斷和治療，能夠明顯提高患者的預后。現(xiàn)有診斷結腸癌的指標主要有CEA，但其缺乏靈敏度和特異性，對早期診斷結腸癌的臨床意義有限[6]。miRNA是一類非編碼RNA，長度一般18～26個核苷酸，在多種腫瘤中表達出現(xiàn)明顯的改變，并且證實參與了腫瘤增殖、遷移和轉移，并且參與了人體多種病理和生理過程[7]。近年來在結腸癌組織中發(fā)現(xiàn)多種miRNA表達出現(xiàn)異常，對結腸癌的早期診斷具有一定的臨床價值，但由于標本組織獲取過程較為復雜，操作困難，患者的依從性較差等缺點，一定程度限制了在臨床的推廣運用[8]。而外周血中的miRNA存在比較穩(wěn)定，在酸性或者堿性條件下均能穩(wěn)定存在，并且在惡性腫瘤病理學特征，臨床診斷和預后方面具有較高的臨床價值[9]。故miRNA被認為是一種非常有前途的腫瘤標記物，為腫瘤的早期診斷和預后的判定提高了新的思路。

本組研究發(fā)現(xiàn)結腸癌患者血清miR-224-3p表達水平明顯高于結腸息肉組和健康對照組，并且發(fā)現(xiàn)結腸息肉組明顯高于健康對照組，手術后患者血清miR-224-3p表達水平出現(xiàn)明顯下降，說明miR-224-3p參與了結腸癌發(fā)生發(fā)展過程，血清miR-224-3p表達與結腸癌具有明顯相關性。現(xiàn)已知miR-224-3p多種惡性腫瘤如宮頸癌，乳腺癌和結腸腸癌均出現(xiàn)表達升高，并認為參與了腫瘤的多種病理生理過程如腫瘤的侵襲、轉移和耐藥等[9]。本組研究還發(fā)現(xiàn)血清miR-224-3p表達水平與浸潤深度、淋巴轉移、血管浸潤、TNM分期和分化程度具有明顯相關性，說明血清miR-224-3p表達與腫瘤的惡性程度和分期具有明顯相關性。在3年的隨訪中發(fā)現(xiàn)存活組的血清miR-224-3p表達水平明顯低于死亡組，說明術前血清miR-224-3p表達水平的高低與術后3年死亡存在一定的聯(lián)系。本組研究還顯示在結腸癌患者中血清miR-4669表達明顯低于結腸息肉組和健康對照組，手術后結腸癌患者血miR-4669表達明顯高于術前，說明miR-4669表達是結腸癌的保護因子，并且與結腸癌的發(fā)生發(fā)展具有密切相關，相當于抑癌基因的作用。miR-4669在結腸癌方面研究很少，在多個基因芯片的研究中發(fā)現(xiàn)血清miR-4669表達，可能成為診斷結腸癌和預后判斷的重要指標[14-16]。本組研究還發(fā)現(xiàn)血清miR-4669表達與浸潤深度、淋巴轉移、血管浸潤、TNM分期和分化程度具有明顯相關性，并且發(fā)現(xiàn)結腸癌術后患者3年存活患者血清miR-4669表達水平明顯高于死亡患者，說明miR-4669是結腸癌存活的保護因子。

本組研究發(fā)現(xiàn)血清miR-224-3p和miR-4669表達在診斷結腸癌具有較高診斷效能，當血清miR-224-3p水平>1.82時，其靈敏度為75.%，特異性為96.0%；而當血清miR-4669表達水平≤2.50時，其靈敏度為94.8%，特異性為81.3%。傳統(tǒng)指標CEA>14.9 ng/ml，其診斷結腸癌的靈敏度和特異性分別為62.1%和98.7%，故其靈敏度較差。同時血清miR-224-3p和miR-4669的AUC明顯高于CEA，說明兩者在診斷結腸癌的診斷效能明顯優(yōu)于CEA。將miR-224-3p和miR-4669兩個指標進行二元回歸發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測(miR-224-3p+miR-4669)的靈敏度為94.8%，特異性為89.3%，其AUC為0.962，明顯高于單個指標miR-224-3p和miR-4669，而miR-4669和miR-224-3p的AUC比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明聯(lián)合檢測能夠明顯提高診斷結腸癌的診斷效能。在預測3年內出現(xiàn)死亡的診斷效能方面，發(fā)現(xiàn)當血清miR-224-3p表達水平>2.38時，其靈敏度為93.0%，特異性為68.5%，AUC為0.876，而當血清miR-4669水平≤1.46時，其靈敏度為88.4%，特異性為71.2%，AUC為0.825；2組聯(lián)合檢測AUC為0.845，明顯高于miR-224-3p和miR-4669指標，說明miR-224-3p和miR-4669聯(lián)合檢測能夠提高預測3年內出現(xiàn)死亡的靈敏度和特異性。本組研究說明血清miR-224-3p和miR-4669在診斷結腸癌和預測3年內出現(xiàn)死亡具有較高的靈敏度和特異性，優(yōu)于常規(guī)指標CEA，2個指標具有某種互補性，其具體機制需要進一步研究。

總之，miR-224-3p和miR-4669參與了結腸癌疾病的發(fā)生發(fā)展過程，在結腸癌診斷和預后判斷具有重要的臨床價值。