lncRNA HOXB-AS3靶向miR-379-5p調(diào)節(jié)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的機(jī)制研究

李萍 孫敏 吳偉

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的慢性炎癥性關(guān)節(jié)疾病，但如果不及時(shí)治療，約40%～70%的患者最終將發(fā)展為殘疾[1]。此外，RA還可引起肺部和心血管疾病[2，3]。滑膜成纖維細(xì)胞是RA發(fā)生的關(guān)鍵細(xì)胞，在免疫細(xì)胞或細(xì)胞因子刺激下，滑膜成纖維細(xì)胞的活化、炎性因子以及基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)的分泌是導(dǎo)致RA炎性、骨和軟骨的破壞的直接機(jī)制[4]。既往研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNA)與RA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。lncRNA同源盒蛋白B8基因反義RNA3(HOXB-AS3)是近年發(fā)現(xiàn)的lncRNA。生物信息學(xué)分析顯示，HOXB-AS3可能與miR-379-5p存在直接作用。miR-379-5p已被證實(shí)可抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，發(fā)揮抑癌基因作用[6]。然而，HOXB-AS3能否靶向miR-379-5p在RA中發(fā)揮抗滑膜成纖維細(xì)胞增殖、遷移和侵襲作用尚未可知。本研究通過檢測(cè)RA患者滑膜組織中HOXB-AS3和miR-379-5p的表達(dá)水平，分析HOXB-AS3對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，以期為RA臨床治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 組織來源 選取2017年1月至2018年6月于我院進(jìn)行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的25例RA患者的滑膜組織標(biāo)本(RA組)，男15例，女10例；年齡38～69歲。收集25例關(guān)節(jié)外傷患者(均無RA病史)關(guān)節(jié)置換手術(shù)的滑膜組織標(biāo)本作為對(duì)照組，其中男20例，女5例；年齡43～70歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：風(fēng)濕性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤、肝腎功能不全、妊娠或哺乳期及精神障礙等疾病。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得所有患者知情同意。

1.2 細(xì)胞與試劑 關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞MH7A購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心；miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Master Mix試劑盒購(gòu)于北京天根生物科技公司；miR-379-5p模擬物(miR-379-5p mimics)、mimics陰性對(duì)照(miR-NC)、HOXB-AS3小干擾RNA(si-HOXB-AS3)、亂義無序陰性對(duì)照(si-NC)、miR-379-5p抑制物(anti-miR-379-5p)、抑制物陰性對(duì)照(anti-miR-NC)、PCR引物、野生型/突變型熒光素酶報(bào)告基因載體(WT/MUT-HOXB-AS3)由上海吉瑪制藥公司提供；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit 8，CCK-8)購(gòu)于上海MEC公司；康寧Transwell小室購(gòu)于北京杰輝博高生物技術(shù)有限公司；基質(zhì)膠購(gòu)于美國(guó)BD公司；RIPA緩沖液購(gòu)于南京凱基；TRIzol溶液、二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid disodium，BCA)試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(electrochemical luminescence，ECL)試劑購(gòu)于北京索萊寶生物公司；一抗：兔源細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)抗體、兔源P21抗體、兔源基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP-2)抗體、兔源MMP-9抗體和兔源磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體以及二抗山羊抗兔IgG購(gòu)于上海艾博康貿(mào)易公司。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)檢測(cè)HOXB-AS3和miR-379-5p的表達(dá) 用TRIzol溶液分別從健康對(duì)照者、RA患者滑膜組織中提取總RNA。取1 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，利用使用SYBR Green Master Mix試劑盒于CFX96 qPCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。2-ΔΔCt法檢測(cè)HOXB-AS3(內(nèi)參為GAPDH)和miR-379-5p(內(nèi)參為U6)的相對(duì)表達(dá)水平。HOXB-AS3上游5’-CCCTCCAAGTCCAGTAAGAAGT-3’，下游5’-AGATCCTAAGAGGTGCGAGTTTA-3’；GAPDH上游5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’；miR-379-5p上游5’-GCGCTGGTAGACTATGGAA-3’，下游引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6上游5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 MH7A細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于空氣95%、二氧化碳5%、濕度為70%～80%的37℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分組如下：si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-HOXB-AS3組(轉(zhuǎn)染si-HOXB-AS3)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-379-5p組(轉(zhuǎn)染miR-379-5p mimics)、si-HOXB-AS3+ anti-miR-NC組(共轉(zhuǎn)染si-HOXB-AS3和anti-miR-NC)、si-HOXB-AS3+ anti-miR-379-5p組(共轉(zhuǎn)染si-HOXB-AS3和anti-miR-379-5p)。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 利用脂質(zhì)體2000將miR-379-5p mimic、miR-NC分別與WT/MUT-HOXB-AS3共轉(zhuǎn)染MH7A細(xì)胞，設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞接種24孔板，轉(zhuǎn)染48 h時(shí)收集細(xì)胞，按照雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 CCK-8法檢測(cè)MH7A細(xì)胞活力 取各組對(duì)數(shù)期MH7A細(xì)胞接種于96孔板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照空。培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，每孔加入10 μl的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板至于培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，以空白孔調(diào)零后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處吸光度值(optical density，OD)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MH7A細(xì)胞遷移和侵襲能力 收集細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h時(shí)各組細(xì)胞，使用無血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度。取250 μl細(xì)胞懸液分別加入基質(zhì)膠包被(侵襲實(shí)驗(yàn))或未包被的(遷移實(shí)驗(yàn))Transwell小室，向24孔板下室加入500 μl含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)箱孵育24 h后，取出小室，擦去Transwell小室內(nèi)殘留細(xì)胞和基質(zhì)膠，分別進(jìn)行甲醛固定、結(jié)晶紫染色，顯微鏡統(tǒng)計(jì)穿膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 Western blot檢測(cè)MH7A細(xì)胞CyclinD1、P21、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá) 采用RIPA緩沖液裂解細(xì)胞分離細(xì)胞蛋白，BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。十二烷基硫酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜。膜封閉后，采用一抗溶液孵育膜2 h；洗膜后，二抗溶液孵育膜1 h。ECL試劑顯色后，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析目的條帶的灰度值。以內(nèi)參GAPDH和目的蛋白灰度值比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA HOXB-AS3和miR-379-5p在RA患者滑膜組織中的表達(dá) 與對(duì)照組比較，RA患者滑膜組織中HOXB-AS3的表達(dá)顯著升高，miR-379-5p的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 lncRNA HOXB-AS3和miR-379-5p在RA患者滑膜組織中的表達(dá)

2.2 lncRNA HOXB-AS3靶向調(diào)控miR-379-5p的表達(dá) 采用生物分析軟件LncBase Predicted v.2預(yù)測(cè)HOXB-AS3靶基因發(fā)現(xiàn)HOXB-AS3與miR-379-5p之間具有互補(bǔ)的核苷酸序列。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，miR-379-5p mimics可降低WT-HOXB-AS3的熒光素酶活性(P<0.05)，而對(duì)MUT-HOXB-AS3的熒光素酶活性無明顯影響。與轉(zhuǎn)染pcDNA組比較，轉(zhuǎn)染pcDNA-HOXB-AS3后MH7A細(xì)胞miR-379-5p的表達(dá)顯著降低；與轉(zhuǎn)染si-NC組比較，轉(zhuǎn)染si-HOXB-AS3后MH7A細(xì)胞miR-379-5p的表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見圖1，表2、3。

圖1 HOXB-AS3的序列中含有與miR-379-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

表2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表3 lncRNA HOXB-AS3調(diào)控miR-379-5p的表達(dá)

2.3 抑制lncRNA HOXB-AS3表達(dá)對(duì)RA滑膜成纖維細(xì)胞MH7A增殖、遷移侵襲的影響 與轉(zhuǎn)染si-NC組比較，轉(zhuǎn)染si-HOXB-AS3后MH7A細(xì)胞HOXB-AS3的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，表明MH7A細(xì)胞HOXB-AS3的表達(dá)受到抑制。抑制lncRNA HOXB-AS3表達(dá)后MH7A細(xì)胞在24～72 h增殖活力顯著降低，遷移侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低，CyclinD1和MMP-2蛋白表達(dá)顯著降低，p21蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)。見圖2，表4。

表4 抑制lncRNA HOXB-AS3表達(dá)對(duì)RA滑膜成纖維細(xì)胞MH7A增殖、遷移侵襲的影響

圖2 增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)；A si-NC；B si-HOXB-AS3

2.4 miR-379-5p過表達(dá)對(duì)RA滑膜成纖維細(xì)胞MH7A增殖、遷移侵襲的影響 與轉(zhuǎn)染miR-NC組比較，轉(zhuǎn)染miR-379-5p后MH7A細(xì)胞miR-379-5p的表達(dá)水平顯著升高。過表達(dá)miR-379-5p后，MH7A細(xì)胞在24～72 h增殖活力顯著降低，遷移侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低，CyclinD1和MMP-2蛋白表達(dá)顯著降低，p21蛋白表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5，圖3。

圖3 增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)；A miR-NC；B miR-379-5p

表5 miR-379-5p過表達(dá)對(duì)RA滑膜成纖維細(xì)胞MH7A增殖、遷移侵襲的影響

2.5 下調(diào)miR-379-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA HOXB-AS3對(duì)RA滑膜成纖維細(xì)胞MH7A增殖、遷移侵襲的作用 與轉(zhuǎn)染si-NC組比較，轉(zhuǎn)染si-HOXB-AS3后MH7A細(xì)胞miR-379-5p的表達(dá)顯著升高，在24-72 h增殖活力顯著降低，遷移侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低，CyclinD1和MMP-2蛋白表達(dá)顯著降低，p21蛋白表達(dá)顯著增加；與轉(zhuǎn)染si-HOXB-AS3+anti-miR-NC組比較，轉(zhuǎn)染si-HOXB-AS3+anti-miR-379-5p后MH7A細(xì)胞miR-379-5p的表達(dá)顯著降低，在24～72 h增殖活力顯著升高，遷移侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增加，CyclinD1和MMP-2蛋白表達(dá)顯著升高，p21蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見表6，圖4。

圖4 增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)；A si-NC；B si-HOXB-AS3；C si-HOXB-AS3+anti-miR-NC；D si-HOXB-AS3+anti-miR-379-5p

表6 下調(diào)miR-379-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA HOXB-AS3表達(dá)對(duì)RA滑膜成纖維細(xì)胞MH7A增殖、遷移侵襲的作用

3 討論

lncRNA是一類進(jìn)化保守的內(nèi)源性長(zhǎng)鏈非編碼RNA，其通過與互補(bǔ)的miRNA結(jié)合并抑制其作用在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。既往研究證實(shí)，lncRNA不僅與RA患者的炎癥調(diào)控，還與滑膜成纖維細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲有關(guān)[7,8]。Bi等[9]研究發(fā)現(xiàn)，LINC00162通過抑制miR-4701-5p表達(dá)，促進(jìn)RA患者滑膜成纖維細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Ye等[10]研究發(fā)現(xiàn)LncRNA鋅指蛋白反義1(zinc finger protein antisense 1，ZFAS1)通過抑制RA中的miR-27a來促進(jìn)類成纖維細(xì)胞的遷移和侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)RA患者滑膜組中HOXB-AS3表達(dá)顯著增加，miR-379-5p表達(dá)顯著降低，進(jìn)一步驗(yàn)證二者關(guān)系發(fā)現(xiàn)，miR-379-5p是HOXB-AS3的靶基因，HOXB-AS3對(duì)miR-379-5p具有負(fù)調(diào)控作用。提示HOXB-AS3可能通過靶向miR-379-5p參與RA發(fā)生發(fā)展。

研究顯示HOXB-AS3在上皮性卵巢癌患者中表達(dá)上調(diào)，抑制HOXB-AS3可降低上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[11]。在急性髓系白血病細(xì)胞中也呈高表達(dá)，抑制HOXB-AS3表達(dá)對(duì)白血病細(xì)胞具有抗增殖作用[12]。與上述研究結(jié)果一致，本研究表明抑制HOXB-AS3可降低MH7A細(xì)胞的增殖、遷移和和侵襲能力。CyclinD1是細(xì)胞周期調(diào)控中的關(guān)鍵蛋白，其通過與CDK結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)換具有促增殖作用，而P21通過抑制CyclinD1/CDK復(fù)合物形成具有抗增殖作用[13]。當(dāng)RA發(fā)生時(shí)，巨噬細(xì)胞的活化可促進(jìn)滑膜成纖維細(xì)胞分泌大量的促炎細(xì)胞因子和MMPs，MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致軟骨和骨骼損傷[14]。本研究表明抑制HOXB-AS3表達(dá)后MH7A細(xì)胞CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)降低，P21表達(dá)升高。提示抑制HOXB-AS3表達(dá)可能通過抑制CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)，促進(jìn)P21表達(dá)，進(jìn)而緩解RA進(jìn)展。

研究顯示miR-379-5p在膀胱癌中表達(dá)降低，上調(diào)其表達(dá)可抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[15]。在肝癌中miR-379-5p也呈低表達(dá)，與肝癌的晚期TNM分期和轉(zhuǎn)移相關(guān)，過表達(dá)miR-379-5p可抑制肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和體內(nèi)轉(zhuǎn)移，而抑制miR-379表達(dá)具有相反的功能[16]。在乳腺癌中LINC00665通過抑制miR-379-5p表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展[17]。本研究表明過表達(dá)miR-379-5p后MH7A細(xì)胞增殖活力、遷移侵襲能力、CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平均顯著降低，P21表達(dá)水平顯著升高，與抑制HOXB-AS3表達(dá)的作用一致。進(jìn)一步恢復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示，抑制miR-379-5p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制HOXB-AS3表達(dá)對(duì)MH7A細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。提示，HOXB-AS3通過靶向miR-379-5p可促進(jìn)RA進(jìn)展。

綜上所述，RA患者滑膜組織中HOXB-AS3呈高表達(dá)，miR-379-5p呈低表達(dá)。抑制HOXB-AS3通過靶向miR-379-5p可抑制滑膜成纖維細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。因此，HOXB-AS3和miR-379-5p有望成為RA臨床治療的新靶點(diǎn)。