哮喘患兒血清miR-29b與外周血Th1、Th2細胞失衡的相關性研究

馬媛媛 鐘斌 黃冬平 徐建鋒 王偉光 李文成 邱桂霞

支氣管哮喘是一種兒童時期常見的以氣道炎癥、氣道阻塞、氣流受限、氣道高反應等為主要特征的慢性氣道疾病。近年來由于遺傳、對疾病認知不足、過敏性疾病史等因素影響，我國兒童支氣管哮喘發病率呈逐年上升趨勢[1]。有研究表明，輔助性T細胞亞型1(T helper 1 cells，Th1)/輔助性T細胞亞型2(T helper 2 cells，Th2)比例失衡可能通過促進免疫球蛋白E(Immunoglobulin E，IgE)分泌增多誘導嗜酸粒細胞、肥大細胞增殖，進而促進炎性因子生成和氣道高反應發生并引發哮喘[2]。有研究發現，支氣管肺發育不良嬰兒血漿微小核糖核酸-29b(Micro Ribonucleic Acid 29b，miR-29b)表達水平降低，與患病嚴重程度呈負相關，miR-29b表達上調可通過調節炎性反應改善肺泡形成[3]。Chi等[4]研究報道，miR-29b在慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織中表達下調，可能介導Th1/Th2分化、相關炎性因子和氣道上皮重構調節。本研究通過檢測支氣管哮喘患兒血清中miR-29b表達水平，分析與Th1/Th2失衡及相關炎性因子、患兒肺功能水平關系，探究miR-29b在兒童支氣管哮喘發生發展中的意義，為臨床評估病情及治療提供一定的理論依據，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年5月至2019年5月廣東省婦幼保健院和清遠市婦幼保健院收治的支氣管哮喘患兒104例為研究對象，其中男56例，女48例；年齡4～12歲，平均年齡(8.16±2.53)歲。根據患兒臨床病情進展[5]分為急性發作組51例，臨床緩解組53例。另選取同期在本院體檢健康兒童48例為健康對照組，其中男29例，女19例；年齡(5～12)歲，平均年齡(8.39±2.76)歲。研究組和健康對照組年齡及性別比比較，差異無統計學意義(P>0.05)。受試者家屬均已對本研究知情并簽署知情同意書，本研究經本院倫理委員會批準同意。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①根據中華醫學會兒科學分會呼吸學組制定的《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[5]，確診為支氣管哮喘；②臨床資料完整；③能積極配合本研究。

1.2.2 排除標準：①合并患有過敏性鼻炎、喘息性疾病者；②合并患有系統性紅斑狼瘡、銀屑病等自身免疫性疾病；③ 3個月內使用過糖皮質激素或免疫抑制劑治療。

1.3 主要儀器 實時熒光定量(Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)儀(型號：7900，美國Applied Biosystems公司)、流式細胞儀(型號：FACSCalibu，美國Becton Dickinson公司)、肺功能檢測儀(型號MasterScreen，德國Jaeger公司)、qRT-PCR試劑盒(貨號：3914001，德國Roche公司)、總RNA提取試劑盒(貨號：73404，德國Qiagen公司)、反轉錄試劑盒(貨號：205311，德國Qiagen公司)、酶聯免疫吸附(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(批號：ab178013，美國Abcam公司)。

1.4 方法

1.4.1 樣本采集:入組哮喘患兒于入院后第2天清晨(健康對照組于體檢時)空腹采集外周靜脈血5 ml，其中2 ml經離心后分離上清液于-80℃保存，用于qRT-PCR及ELISA實驗；另外3 ml使用EDTA抗凝，Ficoll梯度離心法分離外周血單個核細胞，用于Th1、Th2細胞檢測。常規收集所有受試兒童體重、血清總IgE、外周血嗜酸性粒細胞計數及肺功能指標1 s量(forced expired volume，FEV1)、用力肺活量(forced Vital Capacity，FVC)、最高呼吸氣流(peak expiratory flow，PEF)等一般資料。

1.4.2 血清miR-29b表達水平檢測:采用qRT-PCR法檢測血清miR-29b表達水平。Trizol法提取總RNA、反轉錄得到cDNA后用于qRT-PCR實驗。反應體系(20 μl)如下：Mix 10 μl，ROX 0.4 μl，cDNA 2 μl，6.0 μl ddH2O，上游引物0.8 μl，下游引物0.8 μl。反應步驟如下：95℃、5 min，1循環；95℃、15 s，62℃、1 min，以上40個循環。采用2-ΔΔCT法計算miR-29b相對表達量。見表1。

表1 qRT-PCR引物

1.4.3 外周血Th1、Th2細胞水平檢測:采用流式細胞術檢測外周血Th1、Th2細胞水平。設置對照管和檢測管后分別加入FITC-CD4、IgG、PE-干擾素-γ(interferon γ，IFN-γ)、PE-白介素-4(interleukin 4，IL-4)。以CD4、IFN-γ雙陽性為Th1細胞，CD4、IL-4雙陽性為Th2細胞。

1.4.4 血清Th1、Th2相關細胞因子水平檢測:采用ELISA法檢測血清IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IFN-γ水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2 結果

2.1 急性發作組、臨床緩解組及健康對照組一般資料比較 急性發作組、臨床緩解組及健康對照組年齡、性別比、體重比較，差異無統計學意義(P>0.05)。健康對照組、臨床緩解組、急性發作組患兒外周血嗜酸性粒細胞、血清總IgE水平依次顯著升高(P<0.05)，肺功能指標FEV1、FVC、PEF水平依次顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 急性發作組、臨床緩解組及健康對照組一般資料比較

2.2 急性發作組、臨床緩解組及健康對照組血清miR-29b、外周血Th1、Th2水平比較 急性發作組患兒血清miR-29b、外周血Th1、Th1/Th2水平明顯低于臨床緩解組患兒及健康對照組(P<0.05)，外周血Th2水平明顯高于臨床緩解組患兒及健康對照組(P<0.05)。臨床緩解組患兒血清miR-29b、外周血Th1、Th1/Th2水平明顯低于健康對照組(P<0.05)，外周血Th2水平明顯高于健康對照組(P<0.05)。見表3。

表3 急性發作組、臨床緩解組及健康對照組血清miR-29b與外周血Th1、Th2水平比較

2.3 急性發作組、臨床緩解組及健康對照組血清相關細胞因子水平比較 健康對照組、臨床緩解組、急性發作組血清IL-2、IFN-γ水平依次顯著降低(P<0.05)，血清IL-4、IL-5、IL-6、IL-10水平依次顯著升高(P<0.05)。見表4。

表4 急性發作組、臨床緩解組及健康對照組血清相關細胞因子水平比較

2.4 哮喘患兒血清miR-29b與外周血Th1/Th2水平相關性 急性發作期及臨床緩解期哮喘患兒血清miR-29b與外周血Th1/Th2水平均呈正相關(r=0.421，P=0.000；r=0.441，P=0.001)。見圖1、2。

圖1 急性發作期哮喘患兒血清miR-29b與Th1/Th2水平相關性

2.5 哮喘患兒血清miR-29b與相關炎性指標及細胞因子水平相關性 哮喘患兒血清miR-29b與外周血嗜酸性粒細胞計數、血清總IgE、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10水平呈負相關(P<0.05)，與血清IL-2、IFN-γ水平呈正相關(P<0.05)。血清miR-29b與哮喘患兒肺功能指標FEV1、FVC、PEF水平呈正相關(P<0.05)。見表5、6。

圖2 臨床緩解期哮喘患兒血清miR-29b與Th1/Th2水平相關性

表5 哮喘患兒血清miR-29b與相關炎性指標及細胞因子水平相關性

表6 哮喘患兒血清miR-29b與肺功能指標相關性

3 討論

兒童期支氣管哮喘癥狀以胸悶、氣急、喘息、咳嗽為主，患兒常出現上呼吸道感染、肺功能變化明顯，嚴重影響患兒身心健康。研究認為，樹突狀細胞、嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞等參與的機體免疫失衡和炎性反應發生在支氣管哮喘發病調控中有重要作用[6]。

Tang等[11]研究發現，慢性阻塞性肺疾病患者血漿中miR-29b表達下調，可能通過調控炎性細胞因子表達參與患者氣道炎癥，與慢性阻塞性肺疾病嚴重程度有關。本研究結果顯示，健康對照組、臨床緩解組、急性發作組哮喘患兒血清miR-29b表達水平依次顯著降低，提示miR-29b表達水平降低可能預示哮喘發生發展。Apolline等[12]研究報道，自身免疫性糖尿病小鼠模型中miR-29b低水平，與自身免疫引起的炎性反應發生有關。Suzanne等[13]研究表明，癌癥放療過程中引起的血管疾病與慢性炎癥激活有關，miR-29b過表達可通過下調炎性因子表達抑制血管炎性反應，提示miR-29b低表達可能與哮喘進展中炎性反應發生有關。

綜上所述，健康對照組、臨床緩解組、急性發作組血清miR-29b水平依次顯著降低，miR-29b低表達可能通過調控Th1/Th2比例失衡，影響相關炎性細胞因子變化，促進哮喘發生發展。但由于本研究方法較為簡單，尚需通過進一步實驗探究相關機制。