共生微生物-腸-腦軸作用的新靶點：小膠質細胞

張雷雷 楊琳 李思詩 倪炯臣

腸-腦軸雙向相互作用的改變不僅與典型的腦腸疾病(如腸易激綜合征)的發病機制和病理生理學有關[1]，同時許多的行為認知類和神經系統疾病與之關系密切，諸多臨床研究試驗證實小膠質細胞參與了許多疾病的發展過程[2-5]。小膠質細胞大量的存在于在中樞神經系統，對大腦發育和穩態尤為關鍵。這些細胞還調節損傷后的組織恢復，它們的功能障礙可能是導致神經退行性疾病和精神疾病的一個因素[6]。小膠質細胞存在于中樞神經系統的所有區域，被廣泛地定義為膠質細胞和免疫細胞；更具體地說，它們可以被定義為過程承載、高度分支的髓細胞和組織駐留的巨噬細胞[7]。它是大腦的主要免疫細胞，幾十年來一直被認為參與大腦對傷害的反應[8]。當感覺到感染或損傷信號時，小膠質細胞從穩態監測狀態轉變為激活狀態，促進抗菌藥物或組織修復程序恢復穩態[9]。小膠質細胞在中樞系統的活動在很大范圍上受細胞因子和趨化因子、神經遞質和其他調節影響各種腦功能的信號傳導途徑的分子的控制[10]。小膠質細胞的活動一度被認為是由血腦屏障(BBB)保護而不受循環系統的影響，但現在卻被認為是可能與中樞神經系統以外的因素(包括腸道)有關。本研究著重論述腸道共生微生物以及代謝產物在中樞神經系統交互的最新進展，尤其是分析小膠質細胞在二者之間的橋梁作用。綜述如下。

1 腸道共生微生物和小膠質細胞

共生微生物與局部免疫細胞之間的相互作用十分明確，特別是對全身免疫有著深遠的影響，而且對腦回路、神經生理和行為也具有調節作用。由于小膠質細胞廣泛參與中樞免疫應答[8]，致使其可能受到腸道共生微生物的影響。鑒于它們的關鍵地位，這就提出了一個問題，即微生物群對大腦回路、神經生理和行為的部分或全部影響實際上是由小膠質細胞直接或間接介導的。有研究表明，腸道炎癥可誘發神經炎癥，進而刺激小膠質細胞活化和酪氨酸途徑，并可激活全身炎癥誘發抑郁癥狀[11]。肥胖可導致全身低炎癥的改變，在對HFD(高纖維飲食)喂養的大鼠中觀察到腸道微生物群改變，增加硬壁菌/細菌學比率、促進炎癥蛋白細菌增殖和循環前炎性脂多糖(LPS)增加，中樞小膠質細胞的激活。此外，二甲胺四環素抑制HFD誘導對迷走神經和中樞小膠質細胞的作用，減少體脂積累[12]。Schmidtner等[13]在嚙齒動物的焦慮抑郁的研究表明，二甲胺四環素治療緩解了抑郁樣表型，其抗抑郁作用是性別和特征依賴性的，降低了小膠質細胞密度(僅在雄性HAB大鼠中)，降進一步低了血漿促炎細胞因子的濃度，并且大鼠盲腸微生物組成隨之改變。這些作用似乎和前額葉皮質小膠質細胞數量減少和微生物組成及其代謝產物的變化有關。顯然在上述研究中疾病狀態下腸道微生物群改變致使循環免疫應答增強和小膠質細胞的活化。

與對照組相比，使用四環素-3(CMT-3)單獨抑制小膠質細胞活化足以引起顯著的降壓作用，這預示著腸道共生微生物可能參與了血壓調節。首次提出，小膠質細胞和某些微生物群落之間的聯系可能對持續性高血壓(HTN)的治療有意義[14]。在對2型糖尿病大鼠試驗中，發現2型糖尿病導致結腸和腦內神經營養因子(GDNF)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)和炎癥標志物(IL-17、IL-6和TLR-2)的紊亂和升高，同時補充植物乳桿菌和菊糖可改善腸道微生物組成，降低炎癥細胞因子水平。不同的飲食習慣對靶器官的作用方式也不一樣，長期食用高脂飲食(HFD)可引起腸道和全身炎癥，降低外周胰島素敏感性，益生元、益生菌或合生元能降低HFD大鼠海馬氧化應激和細胞凋亡，改善HFD喂養大鼠海馬的可塑性，減輕腦線粒體功能障礙，減少小膠質細胞的激活，導致認知功能的恢復[15]。此外，研究者在Shank3-KO小鼠的糞便中檢測到一種顯著改變的微生物群組成，并在肝臟樣本中發現了較高水平的大腸LPS，同時shank3-ko小鼠中檢測到白細胞介素-6和活化星形膠質細胞的增加[16]。Lu等[17]用無菌(GF)小鼠模型發現，生長相關微生物群可以影響早期神經元和少突膠質細胞的發育，這種影響可能是通過對神經炎癥和循環胰島素樣生長因子(IGF-1)的影響介導的。腸-腦軸與星形膠質和少突膠質的聯系可能是由小膠質細胞介導的，無論是在飲食誘導、抗生素參與，或者慢性病模型中，都伴隨著腸道微生物的豐度改變，炎癥介導致使中樞小膠質細胞激活，參與疾病的進程。

2 腸道共生微生物代謝物和小膠質細胞

棲息在機體屏障表面的共生微生物參與多種對人體健康至關重要的代謝過程，包括氨基酸和多糖的發酵；維生素、輔酶和神經遞質的生成；膽汁酸的修飾。通過這些微生物過程產生的代謝物對免疫細胞及其功能狀態有著深遠的影響。盡管這些代謝物中的一些，如短鏈脂肪酸(SCFAs)已經研究了幾十年，SCFA與神經膠質細胞聯系廣泛。豐富的丁酸鹽、丙酸鹽和醋酸鹽可引起廣泛的代謝和神經功能，尤其是小膠質細胞成熟[18]。對HFD喂養的小鼠的丁酸鹽可以減弱老齡小鼠小膠質細胞中促炎細胞因子的表達。此外，小膠質細胞感覺器的基因表達(觀察組)在飲食和年齡上都發生了改變，老年動物在高纖維飲食中表現出更多的抗炎性小膠質細胞特征[19]。丁酸鈉通過激活小菱形酶(Akt)和抑制組蛋白去乙酰化酶(HDACs)激活小膠質細胞的過程誘導小膠質細胞突起可逆性的延長，這些延長同時反映在小膠質細胞的促炎和抗炎狀態的標志物的顯著變化，Akt抑制可阻止丁酸鈉對原代培養小膠質細胞的抗炎作用，消除丁酸鈉對LPS誘導的小膠質細胞突起收縮和行為異常的抑制作用。首先從小膠質突起延長的方向證實了丁酸鈉的抗炎作用[20]。Huang等[21]研究發現，其他經典HDACs抑制劑和小膠質細胞一起孵育，也可誘導小膠質細胞分支和Akt活化，小膠質細胞分支的誘導可能是由HDACs抑制b-羥基丁酸(BHB)所觸發的。BHB誘導的分支形態可能是小膠質細胞極化的上游信號，可能介導BHB在神經炎癥刺激所致抑郁中的抗抑郁作用。此外從小膠質分支對小膠質功能的反饋調節的角度為解釋BHB在神經退行性和神經精神疾病中的神經保護作用提供了一種新的機制，也表明了小膠質細胞是一種具有典型分支形態的天然免疫細胞。與對照組相比，長期攝入高脂高糖飲食(WD)可降低海馬突觸可塑性和腦源性神經營養因子mRNA的水平。WD還激活ERK1/2，降低腦內突觸后密度，提示突觸后損傷。并可在WD喂養的小鼠多臟器中觀察到炎癥信號增加，伴隨著小膠質細胞的激活、生物失調同時，引起神經可塑性降低。此外，WD小鼠的小膠質細胞鉀通道的轉錄水平增加，促炎基因表達增多，這表明炎癥增強[22]。微生物代謝物可能作為一種生物信號參與小膠質細胞病理生理過程，影響小膠質細胞促炎和抗炎狀態對疾病的免疫應答。至關重要的是，SCFA的產生可以刺激小膠質細胞的活動，改變血腦屏障(BBB)通透性的選擇性。SCFAs主要通過激活免疫系統和外周神經系統間接影響大腦[23]。

腸道共生微生物代謝物還參與者其他神經膠質細胞的活化。有研究發現鏈脂肪酸異丁酸(IBA)為星形膠質細胞氣味(Olfr920)配體，通過cAMP和敲除分析，發現IBA通過Olfr920激活了原代皮質星形膠質細胞Gsprotein腺苷酸環化酶cAMP途徑[24]。IBA可降低LPS誘導的星形膠質細胞GFAP表達。LPS誘導的GFAP表達受到IBA激活Olfr920的抑制。當鞘內注射脂肪酸受體1(GPR40)激動劑GW9508可明顯增強脊髓小膠質細胞和星形膠質細胞IL-10和β-內啡肽的免疫染色，GW9508對1日齡新生大鼠原代脊髓小膠質細胞和星形膠質細胞IL-10和β-內啡肽的基因和蛋白表達也有明顯的刺激作用，表明腸道共生微生物通過生物信號分子作用于中樞[25]。有趣的是，Long等[26]用丁酸鈉(NaB)處理的大鼠中觀察到外周神經生長因子(NGF)表達水平的提高。同時，發現NaB灌腸的大鼠中，GFAP和NGF的共表達也增加了2.1倍。值得注意的是，有研究報道丁酸降低了正常血壓(S-D)大鼠星形膠質細胞中過氧化氫酶和一元羧酸轉運體1的mRNA，但自發性高血壓(SHR)中沒有。此外，觀察到SHR星形膠質細胞中特異性炎性細胞因子的水平較高，丁酸處理可增加SHR大鼠星形膠質細胞中腫瘤壞死因子的表達，但對S-D大鼠則無此作用。該發現支持了丁酸鹽對SHR和S-D大鼠星形膠質細胞中與神經炎癥相關的生物能量和轉錄物的差異調節[27]。腸道共生微生物代謝物不僅作用于小膠質細胞，對星形膠質細胞的活化也有影響，也有可能小膠質細胞與星形膠質細胞二者存在直接的信號通訊通道。

3 中樞疾病與小膠質細胞

小膠質細胞具有廣泛的病理生理功能，在發育和穩態中發揮著多種作用，被認為參與了多種神經發育和神經退行性疾病的發病機制。在對大鼠脫髓鞘疾病模型中發現丁酸鹽能顯著改善脫髓鞘，并能在體外直接抑制脫髓鞘和促進再髓鞘形成，并促進少突膠質細胞分化[28]。同樣對亨廷頓病(HD)模型髓鞘中，GF組大鼠前額葉皮質髓鞘相關蛋白水平普遍降低，成熟少突膠質細胞數量減少，與基因型無關。同時，生活在標準條件下的實驗動物的腸道微生物群在科和屬水平上發現了微小的共生細菌差異[29]。中樞促炎因子和小膠質細胞激活在退行性疾病中發揮著重要作用。在AD中，持續產生的促炎癥因子不可避免地觸發神經退行性事件，過量的Aβ導致膠質細胞活化，活化的膠質細胞產生Aβ的惡性循環，促進了一種不可避免的有害條件[30]。醋酸(Ace)是一種具有神經保護作用的SCFA,Ace能顯著減輕APP/PS1小鼠的認知功能障礙，降低CD11b水平；Ace抑制NF-κb65、ERK和JNK的磷酸化，降低Aβ刺激的BV2小膠質細胞COX-2和白細胞介素1β的水平；最后，Ace增加了Aβ刺激的BV2細胞GPR41水平。提示Ace通過上調GPR41和抑制ERK/JNK/NF-κB通路發揮抗神經炎癥作用，Ace能有效改善AD的認知功能，抑制AD模型小鼠的神經炎性反應，為AD的治療提供了新的策略[31]。SCFA可以調節AD患者選擇性的小膠質細胞功能，SCFA在生理微摩爾濃度下，通過刺激THP-1小膠質細胞減少細胞因子和細胞毒素的分泌；甲酸鹽和戊酸鹽單獨降低了刺激的THP-1細胞的吞噬活性，甲酸鹽能減少小膠質細胞產生ROS。值得注意的是，只有將來的體內實驗才能最終確定腸道微生物產生的短鏈脂肪酸以足夠高的濃度進入中樞神經系統，以調節小膠質細胞的活化，并有益地調節AD神經炎癥過程的進展[32]。

小膠質細胞當然也參與精神類疾病的進程，當Abdelli等[38]用PPA、SCFA、益生菌ASD腸道產物分別作用于人神經干細胞(hNSCs)的試驗中發現，當暴露于PPA是神經細胞的增殖發育明顯優于對照組，并且PPA誘導其向膠質細胞過度分化、神經回路紊亂和炎癥反應， 類似于ASD的病理生理基礎，這可能是ASD的前兆。事實上，使用益生菌對固定化應激所致焦慮/抑郁研究中發現，NK33和NK98(兩種益生菌)對LPS誘導的BV-2細胞NF-κB活化有非常明顯的抑制作用。在固定化應激誘導前后，用NK33或NK98灌胃給藥，可顯著抑制小鼠焦慮/抑郁的發生和發展，抑制海馬內活化小膠質細胞的浸潤，降低血液中皮質酮、IL-6和LPS的水平[39]。小鼠接觸氨芐西林會引起焦慮和結腸炎，并增加腸道微生物群中的蛋白菌群，以及糞便和血液中的脂多糖水平，同時減少乳桿菌群。用氨芐西林處理的小鼠的糞便微生物群進行治療，還增加了海馬小膠質細胞、單核細胞、樹突狀細胞的募集。結果證實，氨芐西林暴露可通過單核/巨噬細胞激活的胃腸道炎癥和包括催產素在內的蛋白菌群升高誘發神經炎癥引起焦慮。然而，口服益生菌可減輕氨芐西林引起的焦慮和結腸炎[40]。不僅僅食益生菌對焦慮抑郁有治療作用，對褪黑素治療抑郁癥顯示：葡聚糖硫酸鈉(DSS)治療可通過改變腸道菌群而誘發大鼠抑郁樣行為和神經炎癥，與DSS暴露導致海馬區活化星形膠質細胞和小膠質細胞數量增加有關；補充褪黑素可通過增加SCFA的產生和增強BBB的完整性來逆轉抑郁樣行為和神經炎癥，褪黑素治療導致活化小膠質細胞和星形膠質細胞數量大幅減少，褪黑激素降低FXR-FGF15和ASK1信號通路的激活，有助于改善代謝紊亂。這些結果支持褪黑素對DSS引起的抑郁和肝代謝紊亂的臨床治療價值[41]。在對化療引起的認知障礙中SCFA似乎與認知功能特別相關，因為通過膳食纖維的細菌發酵產生的微生物衍生代謝物能夠調節中樞神經系統成熟、先天免疫和BBB通透性。在無菌小鼠中，小膠質細胞(中樞神經系統中的巨噬細胞)的成熟度因基因表達譜和異常形態的顯著不同而顯著改變。這些小膠質細胞也表現出對病毒或細菌暴露的反應不能被激活，這表明功能性微生物群的存在對適當的中樞神經系統固有免疫反應是必要的。有趣的是，丙酸鈉、丁酸鈉和乙酸鈉(SCFAs)的使用完全恢復了小膠質細胞的成熟度和功能[42]。在對腸道微生物群介導間歇性禁食減輕糖尿病所致認知障礙的實驗中發現28 d的間歇性禁食治療方案通過微生物群代謝產物改善了行為障礙：間歇性禁食增強了海馬體的線粒體生物生成和能量代謝基因表達，重組了腸道微生物群，并改善了與認知功能相關的微生物代謝物。同時發現禁食療法抑制NFκB的活化，下調JNK/p38的磷酸化和Iba-1的蛋白表達，Iba-1是小膠質細胞活化的一個著名標志物[43]。眾所周知，高鈉飲食(HSD)增加認知障礙風險，在對HSD與腦腸軸的研究中發現，HSD8周的小鼠表現出學習和記憶能力受損，HSD顯著降低了類桿菌和蛋白桿菌的比例，增加了革蘭氏菌科和瘤胃球菌科的比例，伴隨著實驗小鼠糞便SCFA濃度在醋酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽的絕對濃度下降低，實驗小鼠的海馬體中Iba-1的表達增加，研究表明HSD可引起小鼠腦內BBB功能障礙和小膠質細胞活化，并使IL-1水平升高，IL-6和TNF-α大腦皮層的表達水平[44]。微生物群通過小膠質細胞誘導的突觸修剪對大腦功能的影響表明，操縱微生物群免疫串擾是治療神經精神疾病的一種很有前途的策略[45]。心身疾病伴隨著體內炎癥信號的提升，小膠質細胞應答，這可能為精神類疾病治療提供一個新的選擇。

人類與腸道微生物群共同進化，這種長期關系是由有助于選擇有益微生物群的調節因子維持的。在既往的研究中忽略了小膠質細胞在中樞疾病和腸道菌群的關系，腸道菌群及其代謝物在中樞疾病作用的可能靶點是：小膠質細胞。大腦和腸道微生物群之間的相互作用在情緒、新陳代謝、認知和運動功能中起著重要作用。微生物群-腸道-大腦軸的破壞可導致多種疾病，包括焦慮、抑郁、多發性硬化癥、帕金森病、阿爾茨海默癥和自閉癥。由于之前研究大多數為臨床前研究，需要展開合適的臨床研究，提供更加有說服力的證據，更好地了解哪些微生物成分直接或間接地向大腦發出信號，如何作用于小膠質細胞，為治療神經系統疾病提供有希望的新靶點。