重組豬α干擾素的安全性及體外抗病毒效果評價

劉延亭 ，宮瑞雪 ，張美美 ，代發文，趙寶凱

（1.北京大偉嘉生物技術股份有限公司 100091；2. 滄州偉嘉畜牧有限公司 061199；3. 樂山師范學院 614099；4. 沈陽偉嘉牧業技術有限公司 110144 ）

干擾素( Interferon，IFN) 是一種由同屬動物細胞產生，具有抗病毒作用的分泌性糖蛋白，目前被認為是先天免疫反應的重要組成部分，也是病毒感染的第一道防線［1］。IFN 因在抗病毒、免疫調節、抗腫瘤等方面具有較好的效果被視為人和動物某些疾病和病毒感染的首選治療性藥物，特別是近些年在治療嚴重急性呼吸綜合征（SARS）和新型冠狀病毒[2-3]（2019-nCoV）上面顯示出的突出效果，已越來越受到科學家們的重視。豬偽狂犬病毒（PRV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是目前除非洲豬瘟病毒外，威脅我國豬群健康的三個最主要病毒，雖然市場上有較多疫苗種類可供選擇，但仍然無法阻止豬場，特別是小規模豬場不定時疫病的暴發，尤其是冬季的PEDV，已對很多養殖場造成了嚴重的經濟損失。因此，在使用疫苗正常免疫的同時，研究相關抗病毒細胞因子的抗病毒效果就顯得很有必要，而豬Ⅰ型干擾素中IFN-α因能誘導啟動全身性和系統性的先天性免疫反應[4]，已成為多數養殖人的第一選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 豬α干擾素原核重組表達載體pET-32a-PoIFN-α，為本公司實驗室構建、保存。

1.1.2 病毒 水泡性口炎病毒（VSV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）NB株、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）等均為本實驗室保存。

1.1.3 細胞 MDBK細胞，購自中國獸醫藥品監察所。ST、PK15、vero、Marc145細胞均為本試驗保存。

1.1.4 其他試劑 胎牛血清（FBS）和DMEM高糖培養基，均購自Gibco公司；內毒素去除試劑盒和內毒素凝膠法檢測試劑盒，均購自南京金斯瑞生物科技有限公司；酵母粉、胰蛋白胨購自OXIOD公司；鎳膠購自康為世紀有限公司；Tris、氯化鈉等購自國藥。

1.2 方法

1.2.1 重組蛋白表達與純化 將含pET-32a-PoIFN-α的菌種按培養基總體積的0.5%接種LB液體培養基，同時加入終體積100μg/ml的氨芐青霉素， 37℃、200 r/min培養至菌液OD600nm達0.4～0.6左右時，加入IPTG至終濃度為0.5mM，28℃、200 r/min誘導過夜，收集菌體。離心獲得的沉淀用pH7.9的Tris-HCl緩沖液重懸，超聲破碎后再次離心，上清液用0.45μm濾器過濾，按照親和層析鎳柱純化說明書進行純化，洗脫液進行SDS-PAGE測定純度。

1.2.2 內毒去除與生物學活性檢測 將目的蛋白洗脫液經ToxinEraserTM樹脂吸收后，再洗脫濃縮，用ToxinSensor?凝膠法內毒素檢測試劑盒檢測樣品中的內毒素含量。并參考《中國藥典（2010版）》附錄“干擾素生物學活性測定法（細胞病變抑制法）”，以牛腎細胞（MDBK）和水泡性口炎病毒（VSV）為評價體系，測定純化重組蛋白PoIFN-α的生物學活性。

1.2.3 安全性測定 采用小鼠試驗法，每批樣品用5只小鼠，注射前每只小鼠稱體重，應為18～22g。每只小鼠腹腔注射供試品0.5mLl，觀察7d。觀察期內，小鼠應全部健存，且無異常反應，到期時每只小鼠體重均應增加，同時設注射DMEM工作液對照組。

1.2.4 體外抗病毒效果評價

1.2.4.1 培養細胞 用含10%FBS的DMEM工作液分別稀釋ST、Marc145和Vero細胞消化液，調整細胞濃度為105/mL，各接種于96孔細胞培養板中，每孔100μLl，于37℃、5%二氧化碳條件下培養6h。

1.2.3.2 干擾素稀釋 用含7%FBS的DMEM工作液將去除內毒素的重組PoIFN-α做10-1、10-2、10-3、10-4稀釋。

1.2.3.3 接種干擾素 棄去96培養板內培養液，加入干擾素稀釋液，每孔100μL，每個稀釋度做6個重復，同時設陰性和病毒陽性對照，37℃、5%二氧化碳條件下繼續培養18h。

1.2.3.4 病 毒 稀 釋 用 含2%FBS的DMEM工 作 液 分別 稀 釋PRV、PRRSV和PEDV至 預 定 濃 度，即PRV至100TCID50/0.1mL、PRRSV至100TCID50/0.1mL、PEDV至100TCID50/0.1mL。

1.2.3.5 接種病毒 棄去96孔培養板內上清液，每孔分別加入100μl各病毒稀釋液，陰性對照孔加入100μL 含2%FBS的DMEM工作液，于37℃、5%二氧化碳條件下培養24～48h。

1.2.3.6 觀察病變情況，記錄結果。

2 試驗結果

2.1 重組純化蛋白檢測結果 重組蛋白用SDS-PAGE電泳結合Bio-Rad Image Lab軟件確定蛋白純度。樣品上樣量不低于1μg，經SDS-PAGE電泳、染色和脫色之后，電泳膠上均只有與目的蛋白分子量相符的條帶，看不到明顯的雜蛋白條帶，且Image Lab軟件分析的純度均在90.0%以上，測定結果見圖1。

圖1 PoIFN-o重組蛋白純度SDS-PAGE鑒定圖

2.2 內毒素及生物學活性測定結果 經ToxinSensor?凝膠法內毒素檢測試劑盒檢測，去內毒素樣品純化液中的內毒素含量為50EU/mL；經細胞病變抑制法測定生物學活性為1.4×109.0U/mL。

2.3 安全性測定結果 試驗組5只小鼠，試驗過程當中，體重均有增加，證明純化的重組PoIFN-α蛋白對動物安全，與對照組無差異。具體結果見表1。

表1 安全性測定結果統計表

2.4 體外抗病毒效果評價結果 重組PoIFN-α蛋白體外抗病毒觀察結果，具體見表2。從結果可知，在體外，重組PoIFN-α蛋白對PRV、PRRSV和PEDV均有一定的抑制或延緩病毒增殖的效果。其中，對PEDV的抑制效果最好，重組蛋白即使1000倍稀釋仍然能夠完全抑制PEDV的增殖；重組蛋白高濃度（10倍稀釋）時，對PRRSV也具有完全抑制其增殖的效果。

表2 重組PoIFN-α蛋白體外抗病毒效果評價匯總結果

3 討論

干擾素是所有抗病毒藥物中最為廣譜、高效、生物學活性廣泛的特效治療性藥物。除了日常臨床中應用于抗病毒作用外，還具有調節動物機體免疫應答，增強細胞和體液免疫反應的特點，可以刺激多種免疫細胞如NK 細胞、T 細胞、巨噬細胞的產生，如用作滅活疫苗佐劑或免疫增強劑[5-7]，對于疫苗的免疫效果具有正向的促進作用。考慮到通過基因工程手段獲得的豬用干擾素無論是含量或是活性，均高于機體受病毒或其他干擾素誘生劑刺激產生的干擾素，因此重組豬α干擾素具有極大的研究及推廣潛力。