面包酵母β-葡聚糖顆粒負(fù)載甲氨蝶呤抗急性單核細(xì)胞白血病的體外研究*

陳妍靈，孫瑩，羅子怡，張冬冬，江宏強(qiáng)，燦燦，譚御心，周芙玲，許小娟

430071 武漢，武漢大學(xué)中南醫(yī)院 血液內(nèi)科(陳妍靈、羅子怡、江宏強(qiáng)、燦燦、譚御心、周芙玲);430072 武漢，武漢大學(xué) 化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院(孫瑩、許小娟);441000 湖北 襄陽，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院 腫瘤科(張冬冬)

急性單核細(xì)胞白血病(acute monocytic leukemia，AMoL)是一類血液系統(tǒng)的惡性腫瘤，是急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)FAB分型中的M5型，占兒童AML的20%，在嬰兒AML中占比甚至超過一半[1]。臨床上，該病常表現(xiàn)為白細(xì)胞增多、髓外浸潤和凝血功能異常[2]。該病治療以藥物化療、骨髓移植以及支持治療為主，但易耐藥復(fù)發(fā)，患者生存率低下[3]。甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)為二氫葉酸還原酶抑制劑，化學(xué)結(jié)構(gòu)與葉酸相似，是一種抗代謝和抗葉酸藥物，可干擾DNA、RNA和蛋白質(zhì)的形成。MTX廣泛應(yīng)用于治療實(shí)體瘤、血液系惡性腫瘤和自身免疫疾病，如乳腺癌、白血病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等[4-5]。然而MTX在水中的不溶性和低生物利用度限制了其臨床應(yīng)用[6]。MTX對熱和光敏感，暴露后易分解，在20℃蒸餾水中的溶解度只有0.01 mg/mL，并且是pH依賴性的，易溶于稀堿，微溶于稀鹽酸，合適pH值為6.6～8.2[7]。腎臟能在短時(shí)間內(nèi)消除大量的MTX，血漿半衰期只有4.5～10 h[8]。由于其半衰期短且消除率高，臨床上需要高劑量給藥，但低水溶性會(huì)導(dǎo)致其生物利用度低，更重要的是高劑量的MTX導(dǎo)致許多嚴(yán)重的毒性作用，例如骨髓抑制、肝毒性、腎毒性、神經(jīng)毒性和肺毒性[9-10]。為了降低毒性并提高治療效果，需要開發(fā)新型MTX緩釋遞送系統(tǒng)。本次研究制備了以面包酵母β-葡聚糖(baker’s yeast-derived β-glucan，BBG)為載體、以生物相容性海藻酸鈣凝膠(alginate gel crossed by Ca2+，Alg)進(jìn)行封裝的MTX緩釋體系(以下簡稱：BBG/MTX/Alg)，并對結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，初步探究了其體外抗急性單核細(xì)胞白血病的毒性及安全性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

面包酵母多糖購于東方酵母有限公司(日本，東京)，由神戶大學(xué)Hishoshi Ashida教授友情提供，β-葡聚糖含量約為75%；氫氧化鈉(NaOH)、鹽酸(HCl)、氯化鈣(CaCl2)、二甲亞砜(DMSO)等化學(xué)試劑購自國藥集團(tuán)，由申試化工提供；MTX購自Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)；海藻酸鈉(32～250 kDa)購自上海源葉生物技術(shù)有限公司，并測定其在25℃下0.1 M NaCl水溶液中的特性粘度([η])為12.562 dL/g；胎牛血清，胰蛋白酶，購自Gibco；RPMI-1640培養(yǎng)基，DMEM培養(yǎng)基，IMDM培養(yǎng)基，PBS緩沖液，購自Hyclone；雙抗(青霉素和鏈霉素) ，購自Biosharp；CCK-8試劑盒，購自日本同仁；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒，細(xì)胞周期試劑盒，購自聯(lián)科生物。

1.2 細(xì)胞系及培養(yǎng)

人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株THP-1和MV-4-11購自中國科學(xué)院(上海)細(xì)胞庫。正常細(xì)胞株小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3-E1、人成骨細(xì)胞hFOB1.19由武漢大學(xué)中南醫(yī)院科學(xué)研究中心保存。THP-1培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基；MV-4-11培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的IMDM培養(yǎng)基；MC3T3-E1、hFOB1.19培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。以上細(xì)胞均于37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.3 主要儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì)，Shimadzu UV-2600，日本；X射線粉末衍射(X-ray diffraction,XRD)儀，Rigaku Miniflex600，日本；透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)，JEM-2100F，日本；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，Thermo，德國；恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，Heraeus，德國；超凈臺(tái)，蘇州蘇凈；酶標(biāo)儀，UNICO，上海；流式細(xì)胞儀，BD，美國；電子分析天平，Sartorius，德國。

1.4 方法

1.4.1 BBG/MTX/Alg的制備 基于MTX易溶于稀堿，微溶于稀鹽酸的特性，采用溶解-沉淀法[11]制備BBG/MTX/Alg，具體步驟為：將250 mg MTX粉末分散在5 mL去離子水中，添加3.5 mL濃度為0.25 M的NaOH溶液，從而得到澄清的MTX·2Na溶液。然后加入1 g BBG，持續(xù)攪拌12 h后離心收集上清。根據(jù)上清體積，加入適量HCl中和，攪拌10 min，同時(shí)使BBG內(nèi)部MTX沉淀。離心收集沉淀，超純水清洗后凍干。為了進(jìn)一步將MTX固定在BBG中，將BBG/MTX凍干粉浸泡在0.5%的海藻酸鈉中并攪拌6 h。 5 000 rpm離心10 min，棄上清。將沉淀邊添加邊攪拌至50 mL 2% CaCl2溶液中，隨后靜置15 min，離心去上清，沉淀用超純水漂洗后凍干，便得到水凝膠固定包裹在BBG中的MTX(BBG/MTX/Alg)。BBG/MTX/Alg為黃色粉末，室溫避光保存于干燥器中。

1.4.3 XRD 通過粉末衍射儀測定BBG、MTX、BBG/MTX/Alg的X射線衍射光譜，掃描區(qū)域設(shè)置為2θ=3°～40°，步距為0.02°，掃描速度為2°/min。

1.4.4 載藥量測定 將BBG/MTX/Alg溶于DMSO，并使用紫外分光光度計(jì)在303 nm處測量其紫外吸收。配置MTX溶于DMSO的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，并測定其紫外吸收，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。基于標(biāo)準(zhǔn)曲線得到載入MTX的重量，再根據(jù)公式載藥量(%)=(載入MTX的重量/BBG/MTX/Alg的總重量)× 100%計(jì)算MTX在凍干BBG/MTX中的載藥量。

1.4.5 體外藥物模擬釋放 模擬藥物體外胃腸道釋放條件：胃液pH通常位于1～2之間[12]，食物或藥物停留大約1～3 h，使用0.04 M HCl溶液作為模擬緩沖液，pH值為1.2；腸液pH值約為5.5～7.5[12]，使用0.9% NaCl緩沖液作為模擬緩沖液，pH值為7。稱取5 mg BBG/MTX/Alg載藥顆粒，分散于1 mL 0.9% NaCl溶液，置于截留分子量8～10 kDa透析管中。將透析管放置于80 mL胃液模擬液(pH1.2的HCl溶液)中，37℃下70 rpm模擬釋放。在設(shè)定時(shí)間點(diǎn)取出1 mL模擬液，并迅速加入等量新鮮模擬液。使用紫外分光光度計(jì)在303 nm下測量紫外吸收，并計(jì)算MTX的累積釋放量。2 h后將透析管轉(zhuǎn)移至80 mL腸液模擬液(pH7的0.9% NaCl溶液)，后期實(shí)驗(yàn)步驟同上。模仿藥物體外緩沖液釋放條件：使用0.9% NaCl溶液作為釋放介質(zhì)，測量方法同上。

1.4.6 細(xì)胞增殖/毒性實(shí)驗(yàn)(CCK-8法) 取實(shí)驗(yàn)細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)染色后，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)并測定細(xì)胞活力。取2×104/100 μL每孔的標(biāo)準(zhǔn)均勻鋪于96孔板中，每個(gè)試驗(yàn)孔至少設(shè)計(jì)三個(gè)副孔，培養(yǎng)箱孵育過夜后進(jìn)行藥物處理。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定實(shí)驗(yàn)組BBG/MTX/Alg用生理鹽水稀釋至終濃度為50、100、200、400 ng/mL，對照組為等量生理鹽水。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處理相應(yīng)時(shí)長后，每孔加入10 μL CCK-8檢測工作液，混合均勻后置于培養(yǎng)箱避光孵育1～4 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度值(OD值)，再根據(jù)公式細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔OD值-空白對照孔OD值)/(對照組OD值-空白對照孔OD值)×100%計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4.7 細(xì)胞凋亡檢測(Annexin V-FITC/PI) 取實(shí)驗(yàn)細(xì)胞1×106/2 mL每孔的標(biāo)準(zhǔn)均勻鋪于6孔板中，培養(yǎng)箱孵育6 h后進(jìn)行藥物處理。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組BBG/MTX/Alg終濃度為1 μg/mL，對照組用等量生理鹽水。處理24 h后收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS離心洗滌2次，用500 μL的1×Binding Buffer重懸細(xì)胞。每管加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育5 min。隨后在流式細(xì)胞儀上通過FITC通道檢測Annexin V-FITC和通過PE通道檢測PI。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4.8 細(xì)胞周期檢測 取實(shí)驗(yàn)細(xì)胞1×106/2 mL每孔的標(biāo)準(zhǔn)均勻鋪于6孔板中，培養(yǎng)箱孵育6 h后進(jìn)行藥物處理。實(shí)驗(yàn)組BBG/MTX/Alg終濃度為1 μg/mL，對照組用等量生理鹽水。處理24 h后收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS離心洗滌1次，加入1 mL DNA Staining Solution和10 μL Permeabilization Solution，輕柔渦旋振蕩混勻，室溫避光孵育30 min。選擇低速上機(jī)，流式細(xì)胞儀檢測處理前后細(xì)胞周期變化。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差呈現(xiàn)。兩組數(shù)據(jù)選用t檢驗(yàn)，多組間分析選用方差分析。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。流式分析數(shù)據(jù)主要應(yīng)用CytExpert 2.3進(jìn)行分析。XRD數(shù)據(jù)采用Origin 2019b進(jìn)行分析。

經(jīng)費(fèi)的支持也是機(jī)構(gòu)庫發(fā)展必不可少的物質(zhì)條件之一，因此，機(jī)構(gòu)庫建設(shè)者就要積極主動(dòng)地想辦法來籌措經(jīng)費(fèi)。要解決經(jīng)費(fèi)問題，可以采取多渠道并進(jìn)，主要有以下幾種方式：（1）國家層面的經(jīng)濟(jì)資助。（2）行業(yè)范圍的經(jīng)濟(jì)資助。（3）機(jī)構(gòu)知識(shí)庫使用單位的贊助。（4）圖書館作為社會(huì)性的公益事業(yè)單位，可以通過建立圖書館基金會(huì)的方式，接受校友、企業(yè)和熱心人士等的捐贈(zèng)來籌集發(fā)展資金。（5）國外項(xiàng)目資助委員會(huì)的經(jīng)費(fèi)。

2 結(jié) 果

2.1 BBG/MTX/Alg的制備

按1.4.1的步驟，通過重沉淀法將橙黃色小分子藥物MTX載入到乳白色BBG粉末的空腔內(nèi)，并用Alg進(jìn)一步固定，得到淡黃色BBG/MTX/Alg復(fù)合藥物。BBG、MTX、復(fù)合藥物BBG/MTX/Alg的實(shí)物如圖1所示。

圖1 BBG、MTX和BBG/MTX/Alg的圖片

2.2 BBG/MTX/Alg的表征

2.2.1 TEM形貌表征 BBG、BBG/MTX/Alg橫截面的TEM圖像如圖2所示，呈扁平態(tài)，可見BBG內(nèi)部為中空結(jié)構(gòu)，封裝MTX后，BBG/MTX/Alg依然保持著BBG的形態(tài)，但顯示出更高的襯度，表明MTX成功載入BBG空腔并保持BBG自身結(jié)構(gòu)不變。

圖2 BBG和BBG/MTX/Alg形貌特征

2.2.2 XRD圖譜 為了進(jìn)一步進(jìn)行物相分析，BBG、MTX、BBG/MTX/Alg行XRD，衍射光譜如圖3所示。MTX在9.3°、13.7°、14.1°、19.6°、27.8°處顯示出特征性晶體峰，與Agrawal[13]等報(bào)導(dǎo)的MTX的XRD圖譜一致。BBG與BBG/MTX/Alg的XRD圖譜在6.4°處均表現(xiàn)出Hisamatsu等[14]曾報(bào)道的三螺旋酵母β-葡聚糖有序排列晶體峰，說明BBG依然保持著原有的結(jié)構(gòu)和部分結(jié)晶。但BBG/MTX/Alg中未見MTX結(jié)晶峰，表明MTX被封裝在BBG顆粒內(nèi)，且呈非晶態(tài)，可能是由于MTX在重沉淀的過程中來不及結(jié)晶。

圖3 BBG、MTX和BBG/MTX/Alg X射線粉末衍射光譜

2.2.3 載藥量及體外藥物模擬釋放 通過紫外分光光度計(jì)測得BBG/MTX/Alg中MTX的負(fù)載量約7.8%。其體外藥物釋放效率如圖4所示，在2 h的胃液模擬液中MTX的累積釋放率小于15%，能保證后續(xù)腸道中BBG/MTX/Alg負(fù)載的MTX具有足夠的濃度。另一方面，pH值對藥物釋放速率有明顯影響，當(dāng)0～2 h處于胃液模擬液中時(shí)，藥物釋放速率明顯較生理鹽水中快，并對后續(xù)釋放有促進(jìn)作用，這可能是因?yàn)楹Ｔ逅猁}凝膠在酸性環(huán)境下具有更強(qiáng)的溶脹特性[15]。但BBG/MTX/Alg中包裹的MTX在24 h釋放率均達(dá)到95%左右，這有利于體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供參考。

圖4 BBG/MTX/Alg模擬在胃腸道及0.9% NaCl中的MTX釋放

2.3 各組細(xì)胞增殖抑制率

2.3.1 BBG/MTX/Alg對AML-M5增殖的影響 不同濃度不同時(shí)間BBG/MTX/Alg處理THP-1和MV-4-11后結(jié)果如圖5所示，可見與等量生理鹽水對照組即藥物濃度為0相比，BBG/MTX/Alg能有效抑制AML-M5細(xì)胞的增殖，且細(xì)胞增殖抑制率呈濃度及時(shí)間依賴性。

圖5 BBG/MTX/Alg對THP-1和MV-4-11增殖的影響

2.3.2 BBG/MTX/Alg對正常細(xì)胞的毒性 為了確定藥物的安全性，我們進(jìn)一步檢測了BBG/MTX/Alg對正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性。根據(jù)Vis-UV光譜法測得的BBG/MTX/Alg中MTX的載藥量比例，以等量游離MTX作為對照組，不同濃度BBG/MTX/Alg作為實(shí)驗(yàn)組處理正常細(xì)胞系24 h，結(jié)果如圖6。可見在200 ng/mL以下未見BBG/MTX/Alg細(xì)胞毒性(P< 0.05)，而在較高的濃度，BBG/MTX/Alg對MC3T3-E1和hFOB1.19的細(xì)胞毒性比等量游離MTX的毒性小。

圖6 BBG/MTX/Alg和MTX對正常細(xì)胞的毒性

2.4 BBG/MTX/Alg對THP-1和MV-4-11凋亡的影響

BBG/MTX/Alg處理后，THP-1及MV-4-11細(xì)胞凋亡率顯著升高。與THP-1對照組(7.27%±3.29%)相比，1 μg/mL BBG/MTX/Alg處理THP-1 24 h時(shí)，細(xì)胞凋亡率為34.22%±3.77%。與MV-4-11對照組(11.63%±4.72%)相比，1 μg/mL BBG/MTX/Alg處理MV-4-11 24 h時(shí)，細(xì)胞凋亡率為46.1%±2.10%。差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖7、8)。

圖7 BBG/MTX/Alg促進(jìn)THP-1和MV-4-11凋亡

圖8 BBG/MTX/Alg作用后THP-1和MV-4-11的凋亡率

2.5 BBG/MTX/Alg對THP-1、MV-4-11周期的影響

細(xì)胞周期流式檢測結(jié)果如圖9、10所示，與對照組相比，BBG/MTX/Alg處理后，THP-1及MV-4-11處于G0/G1期的細(xì)胞比例均明顯上升，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.0001),這提示BBG/MTX/Alg處理后阻滯細(xì)胞于G0/G1期。

圖9 BBG/MTX/Alg對THP-1和MV-4-11細(xì)胞周期的影響

圖10 BBG/MTX/Alg作用后THP-1和MV-4-11各周期比例

3 討 論

白血病是血液系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，占2020年全球癌癥新發(fā)人數(shù)的2.5%和死亡人數(shù)的3.1%[16]。AML-M5是最常見的急性白血病之一，與其他AML亞型相比，混合系白血病基因(mixed lineage leukemia,MLL)重排和不良預(yù)后基因更多是其遺傳學(xué)特點(diǎn)[17]。AML-M5發(fā)病急，化療敏感性差，化療后復(fù)發(fā)率高。診斷為AML-M5的老年患者由于治療引發(fā)的不良反應(yīng)導(dǎo)致差的預(yù)后，其平均總生存期僅5～10個(gè)月[18]。因此,需要尋找毒性更小且更有效的治療方式來應(yīng)對AML-M5。其中，口服緩釋制劑因釋藥緩慢，血藥濃度“峰谷”波動(dòng)小，可避免超過濃度范圍的毒副作用，又能維持療效，具有給藥方便、用藥次數(shù)少、毒性小、藥效高、開發(fā)周期短等優(yōu)勢，引起了越來越多關(guān)注。

MTX作為常用葉酸拮抗劑，是治療白血病及其他癌癥的有效藥物，它可以競爭性地抑制葉酸合成的關(guān)鍵酶，進(jìn)一步阻止嘌呤和嘧啶地合成，從而抑制腫瘤細(xì)胞地生長[19]。MTX價(jià)格便宜，最方便的給藥途徑是口服，然而其滲透性低溶解性差，在胃腸道中的吸收主要通過質(zhì)子依賴的主動(dòng)吸收，且具有濃度依賴性，因此口服MTX生物利用度較低。MTX缺少靶向性，在腸道部位對正常腸道上皮細(xì)胞也有傷害作用，因此副作用較大，在臨床應(yīng)用上受限。目前已經(jīng)報(bào)道了許多類型的新型MTX緩釋遞送系統(tǒng)，例如納米顆粒、脂質(zhì)體、聚合物膠束、微球等[20-21]，能夠?qū)崿F(xiàn)MTX的緩慢釋放和靶向治療，取得較好的疾病治療效果，但仍存在一些問題，比如釋放時(shí)長遠(yuǎn)大于胃腸道停留時(shí)間或使用的交聯(lián)劑對胃腸道產(chǎn)生毒性。

近年來，由于天然多糖良好的生物活性及生物相容性，其作為藥物緩釋載體的功能引起廣泛關(guān)注[22]。酵母多糖作為美國食品藥品監(jiān)督局認(rèn)定的安全食品成分，是酵母細(xì)胞壁的主要成分，為水不溶性多糖，其主要成分為β-1,3-D-葡聚糖，含有少量β-1,6-D-葡聚糖。采取不破壞酵母細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的溫和化學(xué)提取方法，可以得到保持酵母細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)形態(tài)的酵母β-葡聚糖顆粒，呈中空結(jié)構(gòu)，粒徑2～4 μm，是藥物釋放的天然載體[11,23]。在腸道部位，酵母β-葡聚糖顆粒能夠在腸道部位通過小腸 M 細(xì)胞主動(dòng)吸收的方式進(jìn)入體內(nèi)[24]，可促進(jìn)負(fù)載藥物在腸道部位的吸收，減少副作用。另外，酵母β-葡聚糖具有良好的生物活性，課題組前期研究已證明BBG具有良好的抗炎活性[23]。除此之外，β-葡聚糖還具有良好的免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤活性等[25]，相比于合成高分子藥物載體，酵母β-葡聚糖顆粒作為藥物載體具有其內(nèi)在優(yōu)勢。

MTX呈弱酸性，在堿性條件下可溶，在中性和酸性條件下水不溶，利用該特點(diǎn)，本研究通過調(diào)節(jié)pH，將MTX溶解后重新沉淀載入BBG的空腔，為了實(shí)現(xiàn)MTX在BBG空腔內(nèi)的緩慢釋放，我們利用生物相容性良好的Alg封裝，制備MTX緩釋制劑，以期提高口服MTX的療效及減少毒性。透射電鏡和XRD表征實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證明MTX成功載入BBG空腔。口服藥物載體的第一道挑戰(zhàn)就是通過胃部強(qiáng)酸性環(huán)境時(shí)保證載體的完整性和穩(wěn)定性，體外模擬胃腸道釋放實(shí)驗(yàn)證明，BBG/MTX/Alg復(fù)合物在pH=1.2的模擬胃液中2小時(shí)藥物釋放量低于15%，大部分MTX通過載體到達(dá)腸道部位，保證BBG/MTX/Alg到達(dá)腸道部位 MTX 依然具有足夠的有效劑量，到達(dá)腸道部位后3～10小時(shí)MTX 的累積釋放量急劇增加，在10 h內(nèi)達(dá)到 70%左右，然后緩慢釋放，在 24 h 釋放量達(dá)到95%左右，使 MTX 在腸道部位迅速達(dá)到有效的吸收濃度，并長時(shí)間維持有效濃度，這有利于藥物于胃腸道安全釋放及被吸收。

課題組前期研究已證明BBG負(fù)載MTX顆粒可以有效促進(jìn)MTX在結(jié)腸炎治療中的臨床應(yīng)用。[11]由于MTX還具有良好的抗白血病特性，課題組進(jìn)一步合作研究BBG負(fù)載MTX抗急性單核細(xì)胞白血病的效果，并根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整藥物成分，以期得到更佳的釋放速率與抗白血病效果。體外實(shí)驗(yàn)證明，新合成的BBG/MTX/Alg能有效抑制急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP-1和MV-4-11增殖，隨著時(shí)間的延長，抑制增殖的作用增強(qiáng)。在200 ng/mL的較低濃度下，72 h對THP-1和MV-4-11的增殖抑制率達(dá)75%和70%，隨著處理濃度的增加，MV-4-11增殖抑制作用更強(qiáng)，而增加濃度對THP-1增殖的影響較小。在正常細(xì)胞系中，與等量游離MTX相比，BBG/MTX/Alg處理24 h后對正常細(xì)胞系的毒性較小，說明合成的緩釋制劑具備更低的毒性，提示其更有利于臨床應(yīng)用。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)環(huán)境下BBG/MTX/Alg中MTX的釋放特性可以通過BBG/MTX/Alg在生理鹽水的環(huán)境中釋放來模擬(圖4)，在0～24 h內(nèi)，MTX保持著平穩(wěn)緩慢的釋放，因此相比于游離MTX，BBG負(fù)載后能夠降低MTX與正常細(xì)胞的接觸，從而降低MTX對于正常細(xì)胞的毒性。

細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與生理鹽水對照組相比，BBG/MTX/Alg能顯著觸發(fā)AML-M5細(xì)胞系的凋亡反應(yīng)，阻滯白血病細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期從而抑制增殖，這與Zhao等[26]合成的寡核苷酸適體-MTX偶聯(lián)物抗AML結(jié)果一致。BBG/MTX/Alg在體外通過抑制白血病細(xì)胞增殖，并阻滯細(xì)胞于G0/G1期促進(jìn)其凋亡，有效抑制白血病細(xì)胞生長，且對正常細(xì)胞具有更低的毒性，說明BBG作為MTX的緩釋載體，能夠保證MTX發(fā)揮正常的藥效，并降低對正常的毒性，具有一定的應(yīng)用前景。

綜上所述，BBG/MTX/Alg因其低毒高效，或可作為良好的抗急性單核細(xì)胞白血病口服緩釋藥。我們的實(shí)驗(yàn)為臨床應(yīng)用MTX治療M5型白血病提供了新的治療手段和理論依據(jù)，BBG/MTX/Alg在體外對白血病細(xì)胞系具有良好的抑制作用，其體內(nèi)代謝途徑、白血病治療效果以及作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

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