含釓對比劑的環境污染現狀、毒性及分析方法

劉洪濤，陳 曦，沈素云，蔣 超，馮順卿，欒天罡*

(1.中山大學 測試中心，廣東 廣州 510275；2.中山大學 生命科學學院，廣東 廣州 510275)

釓對比劑(GBCAs)是目前常用的核磁共振(MRI)對比劑，與其他金屬離子相比，釓離子(Gd3+)由于最外層有7個未成對電子，電子的誘導作用強，弛豫時間長，所以具有良好的順磁性而被廣泛研究[1]。游離的Gd3+因與Ca2+具有相似尺寸，在生物體內會抑制Ca2+參與的生物過程(如與含鈣的酶結合使酶失活，影響鈣離子通道等)，從而產生劇毒[2]。因此，通常會將Gd3+與螯合劑螯合，如二乙基三胺五乙酸(DTPA)、1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四羧酸(DOTA等)，形成穩定的化合物而作為GBCAs使用。1984年Carr首次研究釓噴酸葡甲胺(Gd-DTPA)對人腦腫瘤的強化作用[3]。1987年美國食品藥品監督管理局(FDA)正式批準其作為磁共振造影劑。1988年首個商品化的GBCAs投入市場，其后，各種GBCAs紛紛進入臨床應用。目前商用的GBCAs有9種，按化學結構可分為線型和環型，或離子型和非離子型(見表1)。環型結構能束縛Gd3+，給Gd3+提供更好的保護，因此其比線型結構穩定。離子型環狀的螯合物由于無需多余的螯合，最難釋放Gd3+，因此比非離子型環狀的螯合物穩定。由于含釓造影劑的水溶性強，熱力學性質穩定，在環境中不易分解或除去，大量使用含釓造影劑還會造成地表水的釓含量異常升高。而2000年首次報道一種新疾病——腎源性系統性纖維化疾病(NSF)[4]，2006年流行病學研究提出NSF可能與含釓造影劑的使用相關[5]，含釓對比劑的毒性及環境歸趨引起了科學家的關注。

表1 9種商用含釓對比劑的信息Table 1 Informations of nine commercial gadolinium-based contrast agents

1 環境污染現狀

GBCAs具有很高的親水性，污水處理廠的傳統工藝不能很好地將其去除而進入環境[6]。目前GBCAs的環境風險研究集中在水環境方面。1996年，Bau等[7]首次報道了環境水體中Gd含量異常，發現城市河水中Gd元素含量在稀土元素中的占比遠高于自然占比，異常的Gd含量應來自人為輸入。Kümmerer等[8]估算1999年德國約有超過1 000 kg的Gd排放到地表水中，約占當年全球醫用Gd使用量的5%。 Cyris等[9]基于一定假設條件下，外推出德國到2013年，每年約12噸的Gd通過排污系統進入環境。目前，德國、捷克、法國、美國、日本、韓國、澳大利亞等國家已在地表水中發現Gd含量高于自然水平上百倍，異常Gd含量通常發生在醫療及工業發達的地區[10-24]。在德國的一個污水處理廠出水口，Gd的含量甚至高達mg/L級[9]。Kulaksiz[25]、Tepe[26]、Schmidt[27]等均報道德國柏林自來水中Gd含量從2009年到2012年顯著升高(最高11.5倍)，提示由Gd引起的健康風險持續提高。近年來，農村地區也發現了人為輸入Gd濃度的增高，這可能歸因于接受核磁共振掃描的病人回鄉后體內的GBCAs經排泄進入環境[23]。水環境中Gd的異常引起了科學家關注，源自GBCAs的釓可成為污水中外源性物質的合適指示劑[28]，因此成為新型環境潛在污染物[6，29]。Gd元素可引起生態毒性，研究發現，水生生物(木霉菌、大型蚤、青萍、水芹、鯉魚等)可從水溶液中富集Gd元素[30-33]，富集倍數為3.2～86.4，少數報道發現水系沉積物中含有人為輸入的Gd[34-38]。提示存在Gd通過食物鏈放大影響人類健康的可能。本課題組也在中國南方某城市污水廠入水樣品中檢出4種GBCAs(未發表結果)，提示我國大城市存在GBCAs污染的可能性。

目前,COVID-19疾病的全球傳播導致GBCAs的使用暫時減少，這種由于經濟生產和社會化的癱瘓將在環境中留下強烈信號[39]。除了關閉工廠和企業外，所有國家都在關注新型冠狀病毒對衛生系統的影響，并在為這種前所未有的情況做準備，一些非必要的醫療檢查(包括磁共振成像的使用)和手術被推遲，以便騰出足夠的醫療能力和人員。目前，醫療機構進行的MRI檢查減少了80%，預計GBCAs排放量將顯著減少，這將導致淡水系統中Gd濃度的暫時降低，測量和分析這種瞬態Gd信號可提高人們對環境系統的認識，并為自來水廠有關外源或病原體輸入的風險評估提供更好的數據[40]。未來，由于MRI的不斷增加，水環境中GBCAs濃度可能繼續升高，盡管實際增加的GBCAs濃度很低，但污水處理工藝對飲用水中GBCAs的影響將會引起環境工作者的關注。

2 生物毒性研究現狀

2.1 含釓對比劑與NSF

NSF是被報道的與GBCAs使用有關的疾病，發生在嚴重腎功能損傷病人注射GBCAs后，目前致病機理仍不明確[41]。2006年Grobner提出NSF可能與GBCAs的使用有關[5]，此后的探究提示了釓與NSF疾病的相關性[42-49]，并在NSF患者的腦部、皮膚、組織及血管等位置檢出金屬釓。GBCAs的安全性開始受到質疑[50]，美國、歐洲各國以及我國先后出臺GBCAs安全使用警示[51-54]。

目前NSF疾病與GBCAs相關性的研究主要分為兩部分：GBCAs金屬轉移分析;金屬釓刺激產生NSF疾病的原因。實驗分為體外實驗和體內實驗，動物實驗模型包括：細胞模型(主要以成纖維細胞為主)、血液、人皮膚、活體動物模型(以小鼠為主)等[55-70]。Kimura等[55]在體內注射釓雙胺(Gd-DTPA-BMA)、Gd-DTPA和釓特酸葡甲胺(Gd-DOTA)，結果顯示注射Gd-DTPA-BMA的病人體內Zn的含量最高。Gd-DOTA增加，Zn的排放量不明顯，Gd-DTPA增加，有少量Zn的排放，而Cu的排放不受三者影響。Puttagunta等[58]進行Gd-DTPA、Gd-DTPA-BMA等GBCAs體內轉化實驗，結果證明有金屬轉移，使用Gd-DTPA-BMA的病人尿液中鋅含量顯著升高。Tweedle等[59]發現GBCAs在體外可發生金屬離子置換，產生游離的釓離子。Telgmann等[60]體外實驗評估Gd-DTPA、Gd-DOTA與鐵之間的金屬離子轉移，證明Fe3+與GBCAs在血漿中需較長的時間后發生離子轉化，說明GBCAs在腎病病人體內的半衰期較久，導致其與其他金屬離子發生轉移，產生游離釓離子。Idée和Thakral等[61-62]對與GBCAs相關的金屬轉移研究進行總結，提出金屬轉移產生游離釓是誘發NSF疾病的可能作用機制。病人腎功能受損無法將GBCAs完全排除，當造影劑的半衰期超過30 h后，“螯合Gd”與“游離Gd”之間的平衡被破壞，使Gd3+被其他金屬離子置換，從螯合形態解離出來。游離的Gd3+與血漿中的物質結合，從而刺激NSF疾病產生[61]。

在探求釓造成纖維化的誘導機制方面，主要從GBCAs對成纖維細胞造成增殖、對膠原蛋白產生影響[63-66]以及對免疫細胞造成刺激等領域展開[67-69]。Edward等[63]發現GBCAs可誘導成纖維細胞產生過量的乙酰透明質酸和膠原蛋白，并刺激纖維細胞生長。Varani等[64]發現人皮膚在釓雙胺的刺激下膠原蛋白并無顯著變化，但基質金屬蛋白酶(MMP)及組織抑制劑(TIMP-1)增加；釓雙胺處理下的成纖維細胞出現細胞增殖并伴隨MMP及TIMP-1增加。同時，GBCAs濃度不同，對成纖維細胞功能作用發生變化，濃度過高時將抑制部分纖維細胞增殖及相應金屬蛋白酶較少。而Perone等[66]發現GBCAs雖然對膠原蛋白含量并無影響，但膠原分解活性受到影響。且膠原的分解活性與TIMP-1有關，當TIMP-1高達250 ng/mL時觀察到膠原在細胞層中沉積的增加。證明GBCAs加入后導致TIMP-1增加，同時導致膠原降解活性降低，膠原更新減少并易形成膠原蛋白沉淀損害細胞。

關于GBCAs對免疫細胞作用的研究，Vakil等[68]發現釓雙胺干擾單核細胞對纖維細胞分化的信號調節，從而造成纖維化，說明NSF的發病機理可能由于GBCAs影響纖維細胞分化的輔助因子。Newton等[69]通過研究GBCAs刺激下的免疫細胞以及成纖維細胞炎癥變化，解釋游離釓離子刺激促炎和纖維化反應過程，即GBCAs產生游離釓離子，刺激單核細胞、巨噬細胞和炎癥小體等免疫細胞產生炎癥反應，從而導致纖維化。Schmidtlauber等[70]使用酶聯免疫法(ELISA)、蛋白質印跡法和實時定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)法對釓刺激下小鼠內NLRP3炎癥小體和IL-1β白細胞介素含量進行分析，發現釓離子及釓雙胺均可激活NLRP3并誘導IL-1β產生。說明GBCAs會誘發炎癥小體產生炎癥反應，從而誘導纖維化。

2.2 含釓對比劑NSF以外的毒理學終點

目前，GBCAs暴露與毒理學終點(嚴重腎損害患者的NSF除外)之間的關系數據有限。由于NSF病人的增多，非NSF病人在使用GBCAs(特別是多次使用)后的臨床癥狀及毒性研究開始受到關注[71]。近年來，提出了一種新的病理——釓沉積病(GDD)[72]。盡管GDD的病理生理機制、危險因素，甚至作為一種疾病都存在爭議，但GDD已廣泛受到關注。雖然GBCAs相對穩定，但有報道發現GBCAs在體內可分解，使得Gd元素在動物或非NSF病人組織及器官沉積、富集，甚至組織學改變，包括腦組織(特別是齒狀核和蒼白球)、骨頭、皮膚、肝臟等，多次使用GBCAs的病人Gd累積現象更甚[73-80]。Gd在部分組織的沉積是長期的，在骨頭沉積甚至長達8年以上[81]。

GBCAs具有腎毒性，體外實驗證實其可導致腎小管細胞壞死和凋亡[82]；對比豬注射GBCAs與注射含碘造影劑后的影響，GBCAs顯示出更強的腎毒性[83]；Akgun等[84]報道了一位56歲腎功能正常的女性患者連續2次注射GBCAs進行核磁成像檢查，幾天后病人出現急性腎功能衰竭，腎活檢顯示急性腎小管壞死。

GBCAs毒性不限于腎毒性。在GBCAs治療的小鼠中觀察到肝、肺和腎組織的組織病變和分子凋亡[85]。Blasco-Perrin等[86]報道一位58歲女性在核磁共振檢查中使用GBCAs誘發復發性急性胰腺炎(最初給藥3 h后)。另一病例報告顯示GBCAs給藥后出現胰腺炎[87]。一名45歲無癥狀女性在使用GBCAs進行頭顱MRI檢查4 h后出現上腹部疼痛和嘔吐，腹部癥狀出現12 h后，發現嚴重壞死性胰腺炎。

GBCAs證實具有潛在神經毒性。Ray等[88]報道將釓噴酸二甲胺注射到雄性大鼠側腦室后產生了急性神經毒性(肌陣攣、共濟失調、震顫、胼胝體出血和損傷)。Hui等[89]報道了一名接受GBCAs核磁共振成像的婦女腦病的發展，質譜法檢測到病人腦脊液樣本中含有23 000 nmol/mL的釓。

以往的致病機理和毒性研究從分子生物學或臨床癥狀角度出發，缺乏體內釓形態的直接證據。本課題組選擇NIH-3T3細胞作為Gd暴露實驗和Gd結合蛋白鑒定的模型，通過多種分析手段分離鑒定出微管蛋白是NIH-3T3細胞中一種新的Gd結合蛋白，并通過生物實驗證實Gd與微管蛋白的結合能抑制微管蛋白的聚集或解聚，提示Gd3+與微管蛋白結合干擾微管的形成可能是Gd毒性的重要分子機制[90]。

3 分析方法

3.1 檢測方法

目前在GBCAs的環境行為及毒性研究中，采用電感耦合等離子體發射光譜法(ICP-OES)、電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)、X射線熒光光譜法(XRF)對Gd元素總量進行檢測仍是主要手段[91]。Gd元素總量在一定程度上可間接反映GBCAs在環境以及生物組織中的分布、遷移、轉化，但不能獲得GBCAs的形態轉化、代謝及其與其他物質的相互作用等具體信息，因此，對具體GBCAs的檢測變得尤為重要。GBCAs具有水溶性強、結構多樣的特點，針對其中1種或多種GBCAs檢測的方法種類較多，目前國內外報道的檢測方法主要分為色譜類方法、電泳類方法、輻射類方法及聯用類方法。色譜類方法包括高效液相色譜法(HPLC)、尺寸排阻色譜法(SEC)、離子色譜法(IC)；電泳類方法包括毛細管電泳法(CE)、毛細管區帶電泳法(CZE)、膠束電動毛細管電色譜(MEKC)；聯用類方法包括高效液相色譜-質譜法(HPLC-MS)、毛細管電泳-質譜法(CE-MS)、高效液相色譜-電感耦合等離子體發射光譜法(HPLC-ICP-OES)、高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法(HPLC-ICP-MS)等(見表2)。

表2 不同類型樣品中含釓對比劑的分析方法Table 2 Analytical methods for GBCAs in different type of samples

(續表2)

GBCAs的研發過程中，由于Gd3+具有較強的毒性，需對GBCAs進行穩定性研究，HPLC成為主要的方法之一。由于穩定性研究無需對不同的GBCAs進行同時測定，目標物單一，液相色譜柱多采用反相C18[59,92-97]或C8[95,98-99]色譜柱。同時,GBCAs可配制成相對較高濃度的溶液，一般采用紫外可見檢測器檢測。部分Gd絡合物具有熒光響應(如Gd-DOTA)，可在280 nm下激發，316 nm波長處檢測[93]。在HPLC分離檢測某些GBCAs時，由于目標物易電離，需加入離子對試劑(四丁基氫氧化銨)加強目標物在反相柱上的保留(如Gd-BOPTA2-)[95]。穩定性研究實驗中，由于GBCAs的分子量較大，因此可采用尺寸排阻色譜柱將Gd3+與GBCAs分離，可同時測定GBCAs和解離的離子[101]。由于GBCAs極性很強，在反相色譜柱上的保留較差，分析多種GBCAs時會出現共流出現象，為提高多種GBCAs同時測定時的色譜分離度，近年來多采用親水作用色譜柱進行分離。本課題組、Maia等[114-115]采用化學計量學手段對HPLC分離條件進行優化，實現了1種或多種GBCAs的最優化分離。由于部分GBCAs為離子型化合物，因此可采用離子色譜[111,115]、毛細管電泳、毛細管區帶電泳[102,108,110]進行分離，該類方法對于非離子型GBCAs難以分離。為同時檢測離子型和非離子型GBCAs，Andrasi等[109]采用MEKC法分離檢測了6種GBCAs，該方法可直接進樣檢測，適合臨床樣品GBCAs的快速檢測。

HPLC法的靈敏度較低，檢出限較高，一般在μmol/L級。由于環境中GBCAs的含量相對較低，而在研究生物代謝動力學時亦需要更靈敏的方法，因GBCAs含有Gd元素，可通過將分離方法與高靈敏元素檢測方法聯用以改善GBCAs的方法檢出限，HPLC-ICP-OES[105]和HPLC-ICP-MS因此應運而生[101,103,111-113,115]，檢出限可達nmol/L或亞nmol/L級。獲得更低檢出限的另一選擇是采用液相色譜-質譜聯用法，檢出限可至nmol/L或亞μmol/L級，視目標GBCAs的可電離程度而異。本課題組[115]對比了HPLC-ICP-MS、HPLC-MS和IC對于7種GBCAs的檢測能力，GBCAs在ESI的電離差異較大，HPLC-ESI-MS的檢出限較HPLC-ICP-MS高1～2個數量級，而IC僅能分析其中4種離子型化合物，因此HPLC-ICP-MS在多種GBCAs同時檢測時具有較大優勢，可適用于低含量GBCAs的環境、生物應用。但其仍具局限性，由于使用HILIC或反相色譜柱分離，流動相含有高含量乙腈或甲醇，對聯用的ICP-MS儀有硬件要求，需配備小內徑中心管的炬管、有機加氧裝置及半導體制冷裝置，相應的儀器調諧也需在有機進樣模式下進行。CE與MS聯用也可提高方法靈敏度，檢出限可達亞μmol/L級，但僅局限于部分GBCAs。

3.2 樣品前處理

目前所報道的檢測GBCAs的樣品類型分為兩類：一類為水樣，包括地表水、污水、自來水等；另一類為生物樣品，主要為血樣和尿樣，包括血漿、血清、全血等。第一類樣品基質相對簡單，且GBCAs水溶性強，樣品經過濾后可直接進樣。對于含量極低的水樣，有報道通過紅外烘烤的方式進行濃縮富集。第二類樣品因富含大量蛋白質、有機物等基質，多采用沉淀蛋白后，離心過濾進樣分析。

目前研究涉及的樣品類型均集中于上述兩類樣品，因此所涉及的樣品前處理技術相對簡單。隨著含釓對比劑毒性和環境風險評價的進一步開展，更多樣品類型被關注，針對不同類型的樣品特性，將會開發更多的樣品前處理方法以適應檢測需求。

4 結論及展望

GBCAs的使用量日益增長，因其具有很高的親水性，在污水處理廠不能很好被去除而輕易地進入環境。由于GBCAs與NSF疾病密切相關，同時已被證實具有神經毒性、腎毒性、導致組織病變等毒性，進入環境的GBCAs成為新型污染物。各國先后在環境中檢出GBCAs，但其環境歸趨、轉化、生態毒性等信息鮮少，因此開展GBCAs的環境、生態、毒理、健康風險研究意義重大，而準確可靠的分析方法是開展相關工作的重要保障。GBCAs的分析方法以色譜法及色譜與其他檢測技術聯用法為主，其中，基于親水色譜分離的HPLC-ICP-MS法因具有良好的選擇性、準確性及靈敏度，成為GBCAs分析的首選方法。

今后GBCAs的相關研究可考慮從以下3方面進行：①目前所報道的檢測方法多針對水樣、血樣、尿樣等液體樣品，相應的前處理方法簡單，但由于環境中部分GBCAs的含量極微，目前的檢測方法仍未滿足要求，應關注針對沉積物、不同類型生物組織等復雜基質樣品的前處理方法，以減少基體效應、富集濃縮超低含量GBCAs；②目前GBCAs的環境歸趨、轉化、生態毒性信息較少，可開展相關方面研究；③GBCAs暴露與毒理學終點之間的關系數據有限，相關機理尚未明確，可通過建立多種分析方法相結合的檢測系統，結合生物學研究手段，揭示相關毒性機理。