魯米諾循環(huán)化學(xué)發(fā)光的理論與檢驗(yàn)

陳 義，李攻科，張潤(rùn)坤，鐘燕輝

(1.中國(guó)科學(xué)院活體分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所，北京 100190；2.中山大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275；3.淮陰工學(xué)院，江蘇 淮陰 223001；4.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；5.北京分子科學(xué)國(guó)家研究中心，北京 100190)

自1877年Radziszewski發(fā)現(xiàn)絡(luò)吩堿(Lophine，即2,4,5-三苯基咪唑)能在堿性條件下反應(yīng)發(fā)光[1]算起，對(duì)化學(xué)發(fā)光(Chemiluminescence，CL)現(xiàn)象及其分析測(cè)試應(yīng)用的研究已歷經(jīng)一百多年。CL測(cè)定之靈敏、裝置之簡(jiǎn)單、在免疫分析中應(yīng)用之有效，令人印象深刻。遺憾的是CL可用的反應(yīng)不多，測(cè)定方法種類頗少，特別是發(fā)光利用度不高，這也令人驚奇。比如閃光(Flash)型CL測(cè)定可能只利用了快反應(yīng)發(fā)光的峰值，而輝光(Glow)CL測(cè)定也只利用了輝光區(qū)(光強(qiáng)變化平穩(wěn)區(qū))的瞬時(shí)或部分光強(qiáng)積分。為了更有效地利用發(fā)光事件，Zhang等[2-3]等提出了一種循環(huán)化學(xué)發(fā)光(CCL)的新穎測(cè)定方法，他們[4]以魯米諾等發(fā)光體系進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，CCL幾乎能窮盡發(fā)光反應(yīng)，并測(cè)得了一連串隨時(shí)間呈指數(shù)衰減的發(fā)光峰，即ICCL=Ae-t/τ，式中ICCL為扣除背景后的真實(shí)發(fā)光峰強(qiáng)度，A、τ在一定條件下為常數(shù)。該關(guān)系式和常規(guī)CL所用的公式十分相像，但含義肯定不同，只是目前尚未清楚。如能從理論上對(duì)其予以詮釋，勢(shì)必會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)CCL的發(fā)展，擴(kuò)展其應(yīng)用。基此考慮，本文對(duì)CCL進(jìn)行了理論推演，得到了能夠解釋其發(fā)光峰值衰減的公式，并經(jīng)受住了一些關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的檢驗(yàn)。

1 理論基礎(chǔ)

1.1 化學(xué)發(fā)光基礎(chǔ)

CL之所以能用于物質(zhì)的測(cè)定，依據(jù)在于其發(fā)光強(qiáng)度I正比于化學(xué)反應(yīng)速率r:

(1)

式中r的單位為mol·L-1·s-1，正號(hào)指示產(chǎn)物，負(fù)號(hào)為反應(yīng)物；mCL為反應(yīng)級(jí)數(shù)；φ為化學(xué)發(fā)光量子效率，對(duì)于給定的反應(yīng)體系為定值。一般地，CL只是多種平行反應(yīng)中的一種，故φ也可由發(fā)光反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)ki=CL與所有反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)之和Σki的比值求得。經(jīng)過(guò)積分，可將式(1)轉(zhuǎn)化成：

(2)

式中F表示積分時(shí)段內(nèi)總的發(fā)光強(qiáng)度。式(2)表明，F(xiàn)與反應(yīng)物的消耗量或產(chǎn)物的生成量呈線性關(guān)系。

式(1)和(2)均說(shuō)明，凡能影響反應(yīng)及其速率的因素，均會(huì)影響發(fā)光強(qiáng)度，因而都有可能用以構(gòu)建分析測(cè)定方法。它們與3類物質(zhì)有關(guān)：直接參與反應(yīng)的物質(zhì)(X)，介入反應(yīng)的催化劑、增敏劑或抑制劑(Y)，能與CL耦合的反應(yīng)物、催化劑、增敏劑或抑制劑(Z)等，包括一些可以借助化學(xué)衍生等技術(shù)引至CL中物質(zhì)(也記入Z中)。于是，CL可以牽涉非常復(fù)雜的反應(yīng)，可抽象為：

±∑mXiXi±∑pXjYj±∑qYlZl=0

(3)

式中正負(fù)號(hào)分別對(duì)應(yīng)于反應(yīng)物和產(chǎn)物，m、p、q為反應(yīng)系數(shù)。恒容反應(yīng)時(shí)的速率可表示為：

(4)

實(shí)際工作中會(huì)簡(jiǎn)化反應(yīng)以方便實(shí)驗(yàn)。主要技術(shù)是令與待測(cè)物無(wú)關(guān)的成分處于超量水平，這樣可以忽略其變化。以反應(yīng)物X測(cè)定為例，有：

(5)

式中rX指X的反應(yīng)速率常數(shù)，kc包含了超量物質(zhì)之濃度乘積。方程(5)的解為：

(6)

或

cX=cX0e-kt,mX=1

(7)

式(7)對(duì)應(yīng)于一級(jí)或準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)，是CL中最常見(jiàn)的測(cè)量方法，其時(shí)刻t的純化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度為：

I(t)=Idet(t)-Ibac(t)=φkccX0e-kct

(8)

式中Idet(t)是時(shí)刻t測(cè)得的光強(qiáng)，Ibac(t)是此時(shí)的背景光強(qiáng)或基線值。式(8)表明，一級(jí)或準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)的瞬時(shí)發(fā)光強(qiáng)度與反應(yīng)時(shí)間t存在指數(shù)衰減關(guān)系(但這不是CCL的關(guān)系)。對(duì)于特定反應(yīng)體系，給定時(shí)刻t的光強(qiáng)I(t)(如Imax)與cA0呈線性關(guān)系，可做定量測(cè)定。同理，若給定cX0，可測(cè)定kc或發(fā)光量子產(chǎn)率φ。積分式(8)得：

(9)

若令t1=0、t2=t，則有F=BcA0(1-e-kcΔt)，式中B為常數(shù)，Δt=t2-t1≈W為所經(jīng)歷的反應(yīng)時(shí)間，可理解為發(fā)光峰的寬度W。一般地，公式(8)和(9)均可用于閃光型(Flash)或輝光型(Glow)反應(yīng)，關(guān)鍵在于如何設(shè)計(jì)反應(yīng)。

1.2 魯米諾化學(xué)發(fā)光反應(yīng)動(dòng)力學(xué)簡(jiǎn)化

魯米諾(3-氨基-苯二甲酰肼，LuH2)CL體系用途廣泛，可開(kāi)發(fā)性大，目前也是CCL的關(guān)鍵研究體系，所以理論探索由此開(kāi)始。本節(jié)探討其反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和化簡(jiǎn)為準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)的辦法。一般地，魯米諾在pH 10.0～11.0堿性溶液中，可被溶解氧、過(guò)氧化氫、過(guò)硫酸鉀、碘化物、次氯酸鹽、高錳酸鉀、鐵氰化鉀及其納米粒子等氧化劑[5-12]氧化發(fā)光，其中溶解氧因濃度難以調(diào)控而常被過(guò)氧化氫替代，對(duì)應(yīng)的反應(yīng)因此能被辣根過(guò)氧化物酶、黃嘌呤氧化酶、血紅蛋白或肌紅蛋白等[13-14]催化加速，或被Fe3+/2+、Mn2+、Ag+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Cr3+等過(guò)渡金屬鹽或絡(luò)合物[15-19]增敏。根據(jù)文獻(xiàn)[4]，選Co2+與R-或S-手性配體(LR或LS)所形成的手性配合物[Co·LR]或[Co·LS]來(lái)增敏LuH2反應(yīng)。按文獻(xiàn)方法[4]，為了測(cè)定能與[Co·LR]或[Co·LS](合寫為[Co·LR/S])作用的苯乙醇等其他手性分子(記為S-X或R-X或合寫為R/S-X)，須先將兩者的混合溶液注入到含H2O2的載流水溶液中，再將其輸運(yùn)到裝填了負(fù)載有魯米諾(IEP-LuH)的陰離子交換樹(shù)脂(IEP)反應(yīng)池中進(jìn)行流動(dòng)反應(yīng)，由此來(lái)維持H2O2和魯米諾濃度處于超量水平。這種設(shè)計(jì)能將快發(fā)光反應(yīng)試劑鉗制在超量水平，因而具有通用性。在堿性條件下，[Co·LR/S]能加速氧化LuH2，但Co2+自身經(jīng)單電子傳遞[20]也被氧化成Co3+并形成更穩(wěn)定的配合物[Co(Ⅲ)·LR/S·3OH-]。考慮苯乙醇等會(huì)與[Co·LR/S]進(jìn)一步形成配合物，但其配位能力可能弱于羥基，推測(cè)其主要反應(yīng)機(jī)理如下：

式中，APD表示氨基苯二甲酸根。反應(yīng)中Co2+是唯一被消耗掉的反應(yīng)物，屬于消耗型增敏劑而非催化劑。該氧化反應(yīng)即第五步是控速反應(yīng)，故有：

(10)

顯然，在其他濃度超量或維持不變的條件下，該反應(yīng)是關(guān)于配合物[Co(Ⅱ)·LR/S]的準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)，其準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)是魯米諾、OH-、H2O2濃度的函數(shù)，但不包含R/S-X的濃度。kc與R/S-X只存在間接的關(guān)系(k3k4/k-3k-4)。R-X與S-X在手性環(huán)境中的k3k4/k-3k-4必會(huì)有所不同，于是會(huì)影響參與發(fā)光反應(yīng)的鈷配合物的濃度與穩(wěn)定性，最后影響發(fā)光的強(qiáng)度。注意，kc包含了除濃度之外的動(dòng)力學(xué)或熱力學(xué)常數(shù)，因而也是溫度的函數(shù)，即實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)考慮優(yōu)化和控制反應(yīng)的溫度。

2 循環(huán)化學(xué)發(fā)光理論

2.1 流動(dòng)反應(yīng)池中的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)方程

由Co2+配合物增敏的魯米諾發(fā)光體系，可以推導(dǎo)出CCL的峰強(qiáng)度理論關(guān)系式。為簡(jiǎn)化推導(dǎo)過(guò)程，將塞狀樣品在流通池中的流動(dòng)反應(yīng)假想成兩個(gè)步驟：步驟一，不考慮反應(yīng)，只考慮樣品流過(guò)反應(yīng)池的變化；步驟二，不考慮流動(dòng)過(guò)程的變化，只考慮池中的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

由假想步驟一可知，塞狀樣品從進(jìn)樣開(kāi)始到流出反應(yīng)池，此過(guò)程頗似色譜，區(qū)帶會(huì)因縱向擴(kuò)散、橫向(特別是反應(yīng)池中)液-固界面?zhèn)髻|(zhì)等機(jī)制而出現(xiàn)區(qū)帶擴(kuò)張。若組分以線速度υ流動(dòng)，則反應(yīng)池中某一位置x上，待測(cè)組分X的濃度(cX)隨時(shí)間t(=x/υ)的變化，必然也類似于色譜峰，理想時(shí)為正態(tài)分布：

(11)

(12)

由假想步驟二可知，上述已完成了濃度分布的組分X，將在區(qū)帶寬度保持不變的假設(shè)條件下，于反應(yīng)池中進(jìn)行消耗性反應(yīng)。對(duì)于準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)，由公式(7)可知，X在時(shí)刻t的反應(yīng)濃度為：

(13)

與濃度的峰形分布對(duì)應(yīng)，該次發(fā)光強(qiáng)度也必是一峰形分布，且存在極值I1,max:

(14)

該式表明，發(fā)光強(qiáng)度是正態(tài)分布與指數(shù)衰減的混合函數(shù)。因?yàn)橐呀?jīng)假定發(fā)光反應(yīng)只在池中進(jìn)行且無(wú)論反應(yīng)快慢，池中發(fā)光試劑總能維持超量水平，所以容易理解X的發(fā)光峰只與X在流通池中所經(jīng)歷的真實(shí)反應(yīng)時(shí)間Δt1(從進(jìn)入到離開(kāi)反應(yīng)池的時(shí)間)有關(guān)，與池外或峰外時(shí)間t1,non無(wú)關(guān)。由此可以推斷：

(15)

式中，L為反應(yīng)池的長(zhǎng)度，δ為初始區(qū)帶長(zhǎng)度。顯然，該次發(fā)光峰的寬度W1應(yīng)與Δt1近似相等：W1≈Δt1。

2.2 循環(huán)流動(dòng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)方程

在經(jīng)歷了一輪反應(yīng)后，若相關(guān)反應(yīng)物X(如[Co·LR]或[Co·LR]，非發(fā)光試劑)未消耗完全，則可再泵回池中進(jìn)行第二次發(fā)光反應(yīng)。但此次發(fā)光強(qiáng)度會(huì)因?yàn)樯弦惠喎磻?yīng)消耗了一些X而降低。在無(wú)泄漏的封閉循環(huán)反應(yīng)系統(tǒng)中，經(jīng)過(guò)Δt1時(shí)間有效反應(yīng)后，剩下的X正好是新一輪反應(yīng)的起始量，但其分布會(huì)因再經(jīng)過(guò)一個(gè)流動(dòng)周期而繼續(xù)加寬，使方差從原來(lái)的σ1變成σ2。在相同的反應(yīng)池中，其橫截面積S不變，由物質(zhì)不滅定律可知，同一置信度(如99.7%)下，必然有c2,X0×S×3σ2=c1,Xt×S×3σ1即c2,X0σ2=c1,Xtσ1；同理，在無(wú)反應(yīng)發(fā)生時(shí)，歸一化的兩正態(tài)分布峰的底寬均為各自方差的相同倍數(shù)，2(t2,non-t2,max)=4σ2，2(t2,non-t1,max)=4σ1，亦即(t-t1,max)/σ1=(t-t2,max)/σ2，故對(duì)于準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)有：

(16)

于是，在第二輪反應(yīng)中，X在反應(yīng)時(shí)刻t的濃度為：

(17)

類似地，c2,Xt可作為第三輪反應(yīng)的起始濃度，不過(guò)方差從σ2擴(kuò)展到σ3，即

(18)

式中,Δt2為第二輪操作所經(jīng)歷的實(shí)際反應(yīng)時(shí)間。依此類推，可以得到第n次反應(yīng)的濃度分布為：

(19)

于是有發(fā)光強(qiáng)度及其極值表達(dá)通式：

(20)

注意，公式(20)中的tn,max指與循環(huán)次數(shù)有關(guān)的時(shí)間變量，但在實(shí)際操作計(jì)時(shí)中，會(huì)不可避免地包含一些非循環(huán)的冗余時(shí)間t0。從進(jìn)樣到反應(yīng)開(kāi)始之前的這一段時(shí)間內(nèi)，特別容易出現(xiàn)冗余時(shí)間，也可出現(xiàn)時(shí)間不足(t0<0)。在運(yùn)送X的載體流速和反應(yīng)池體積始終不變的條件下，發(fā)光峰時(shí)間tn,max與循環(huán)次數(shù)n和周期T有如下關(guān)系：

(21)

式中，t′為CCL峰值的實(shí)測(cè)時(shí)間。

2.3 循環(huán)化學(xué)發(fā)光實(shí)用公式與檢驗(yàn)

2.3.1近似方程與檢驗(yàn)為檢驗(yàn)方程(20)是否合理，需知道前(n-1)次循環(huán)所用掉的總有效反應(yīng)時(shí)間。在封閉系統(tǒng)中，恒速流動(dòng)時(shí)，可假設(shè)各次有效反應(yīng)時(shí)間幾乎相等或差異可以忽略，則前(n-1)的總反應(yīng)時(shí)間為：Δt1+Δt2+…+Δt(n-1)=(n-1)Δt1=(tn,max/T-1)L/υ，將其代入式(20)得:

(22)

上式表明，在CCL中發(fā)光峰明確地隨測(cè)量時(shí)間增加而衰減(圖1)，由此可以求得kT，這與文獻(xiàn)所觀測(cè)到的現(xiàn)象完全吻合[2]。但公式(22)顯示，同一個(gè)反應(yīng)所測(cè)得A值并非常數(shù)，除了受載體線速度υ和反應(yīng)池參數(shù)L的影響，還會(huì)隨冗余時(shí)間t0的增大而增加。首先，這個(gè)結(jié)論有些奇怪，但利用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行的驗(yàn)證表明是正確的，如表1第二欄所示，這也是在本理論公式推導(dǎo)出來(lái)之前所不知道的；其次,t0的影響可以消除，為此可先通過(guò)A～e-kTt0曲線擬合(圖2)求出kT，再計(jì)算e-kTt0以求得t0=0時(shí)的A值。表1第三欄顯示，校正過(guò)的A值基本不變，其中尚余的變化主要應(yīng)該是由于載體流速變化所造成。文獻(xiàn)[4]采用了往復(fù)式流動(dòng)操作，每一輪反應(yīng)均會(huì)有一次倒向，伴隨有一小段從υ到0再到υ的減速和加速過(guò)程。要消除這種往復(fù)變速的影響，最好的辦法是采用單向恒流操作。注意：因A、B包含k，所以也是溫度依賴型常數(shù)，這再次表明控制溫度對(duì)重現(xiàn)CCL的重要性。

圖1 依據(jù)公式(22)中第一方程繪制的CCL峰強(qiáng)度隨循環(huán)時(shí)間變化的指數(shù)衰減曲線Fig.1 Exponential decay curves of CCL peak intensity with cycle time plotted according to the first equation in formula(22)

表1 公式(22)中A值隨冗余時(shí)間t0的變化Table 1 Variation of A value in formula(22) with the redundant time t0

圖2 公式(22)中A隨t0的實(shí)測(cè)變化點(diǎn)及其擬合曲線Fig.2 Plots of the measured points of A with t0 in formula(22) and their fitting curvesthe conditions were the same as in Fig.1

數(shù)據(jù)從文獻(xiàn)[4]中Fig.2測(cè)得，相關(guān)實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下：反應(yīng)池為圓柱形(60.0 mm×4.0 id mm)，內(nèi)填固載了2.37 mmol/g魯米諾的0.8 g D201×7陰離子交換樹(shù)脂；樣品為0.1 mmol/L的[Co(Ⅱ)·LR]或[Co(Ⅱ)·LR]與0.1 mmol/L R-或S-苯乙醇的混合物，其中LS=(1S,2S)-N,N′-雙[3-氧代-2-(2,4,6-三甲基苯酰)亞丁基]-1,2-二苯基乙二胺，LR=(1R,2R)-N,N′-雙[3-氧代-2-(2,4,6-三甲基苯酰)亞丁基]-1,2-二苯基乙二胺，共有RR、RS、SS、SR四種配對(duì)組合；進(jìn)樣50.0 μL，區(qū)帶折合為反應(yīng)池長(zhǎng)度為δ=50.0/(π22)=3.98 mm，與反應(yīng)池長(zhǎng)度相比可忽略；載體為5×10-5mol/L H2O2，用去離子水(pH 7.0)溶液配制，體積流量為 10.0 mL/mim，換算為反應(yīng)池的線速度為10.0×103/(π22)=796 mm/min=13.3 mm/s。

表2 準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)的兩種測(cè)試方法及其與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的比較Table 2 Two methods for measuring the constant rate of quasi first order reaction kinetics and their comparison with literature data

比較表2中的kT與kc或τT與τc可見(jiàn)，扣除了流速與反應(yīng)池參數(shù)影響后的kc或τc，對(duì)RR與RS、SS與SR之手性識(shí)別能力明顯提高了，強(qiáng)于kT與τT。

公式(22)還揭示出至少2種定量測(cè)試的方法：方法一，選定CCL中的某一個(gè)峰(建議選較高的幾個(gè)峰)，由In,max=(In,det-In,bac)～cX0線性關(guān)系做定量分析；方法二，先擬合求出各濃度的A值，再由A～cA0的線性工作區(qū)做定量分析。前一種方法和傳統(tǒng)CL定量方法頗為類似，不用再做檢驗(yàn)。后一種方法屬于新方法，但目前缺乏文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，暫時(shí)不能驗(yàn)證。但前述關(guān)于A～t0的討論，可以間接檢驗(yàn)本推論的正確性。

2.3.2近似方程的問(wèn)題與對(duì)策如果公式(22)推導(dǎo)完全正確，則以下半對(duì)數(shù)線性方程成立：

(23)

按此公式重繪圖1而得到確實(shí)具有直線關(guān)系的圖3，但圖中的線性相關(guān)性不太強(qiáng)，R2多數(shù)不到0.99；所得斜率kT也能區(qū)分RR與RS、SS與SR之間的差異，但差距縮小了。這兩點(diǎn)說(shuō)明，線性擬合與指數(shù)擬合并不等價(jià)，這不符合數(shù)學(xué)原理，原因可能來(lái)自于前面忽略Δtn之間的差異。為此，需要對(duì)其進(jìn)行修正，補(bǔ)回影響。

圖3 CCL發(fā)光峰強(qiáng)度對(duì)數(shù)與循環(huán)反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系Fig.3 Linear relationship between the logarithm of CCL peak and the cyclic reaction timethe conditions were the same as in Fig.1

圖4 CCL發(fā)光峰寬隨循環(huán)時(shí)間的變化Fig.4 Variation of CCL peak width with the cycle timethe conditions were the same as in Fig.1

方法二，又為半經(jīng)驗(yàn)方法，由文獻(xiàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)CCL峰寬是近似于上凸的漸進(jìn)曲線(圖4)，而其前3、4個(gè)峰有近似于線性的關(guān)系。據(jù)此，可以限定公式(23)的適用范圍是前4個(gè)峰，由此可以得到更近于指數(shù)擬合(表2)的結(jié)果：

上述數(shù)據(jù)表明，單取前四個(gè)峰時(shí)，線性改善并不充分，但只取前三點(diǎn)卻不符合統(tǒng)計(jì)分析的要求。一種提升線性的思路是：加快載體流速，縮短循環(huán)周期。此方法有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)。

2.4 對(duì)映異構(gòu)體競(jìng)爭(zhēng)循環(huán)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)公式

公式(1)已經(jīng)指明，不發(fā)光反應(yīng)降低了發(fā)光反應(yīng)的量子產(chǎn)率。同理，發(fā)光競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)或共反應(yīng)，也會(huì)改變發(fā)光強(qiáng)度。在“1.2”所推測(cè)的機(jī)理中，包含了手性配體R/S-X與OH-對(duì)鈷的配位競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。若R-X和S-X同時(shí)加入，它們之間也會(huì)出現(xiàn)配位競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。若它們的反應(yīng)常數(shù)相同，則發(fā)光不會(huì)有任何變化；若兩者的反應(yīng)常數(shù)不等，則最后的發(fā)光強(qiáng)度也必然不同。為了推導(dǎo)相關(guān)公式，做3個(gè)假想實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)一，把R-X和S-X按xR-X=cR-X/(cR-X+cS-X)=cR-X/cSR-X、xS-X=1-xR-X混合，當(dāng)成一個(gè)SR-X成分進(jìn)行反應(yīng)；實(shí)驗(yàn)二，做同濃度R-X的單獨(dú)反應(yīng)，但反應(yīng)體積只是SR-X的xR-X；實(shí)驗(yàn)三，做同濃度的S-X單獨(dú)反應(yīng)，其總體積只是SR-X的(1-x)。顯然，如果R-X、S-X反應(yīng)互不干擾，且后兩個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物混合后的體積不變，則會(huì)得到與第一個(gè)反應(yīng)相同的結(jié)果，于是存在以下關(guān)系：

(24)

圖5 CCL中混合對(duì)映體準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)常數(shù)與單獨(dú)對(duì)映體常數(shù)存在濃度加權(quán)線性關(guān)系Fig.5 The kinetic constant of two mixed enantiomers in CCL can be weighedly added from that of the single enantiomersthe points were adopted from the Fig.6 and other of reference[2],the solid lines and the shown data were simulated from the points,and the dashed lines were calculated from the fomula(24)(數(shù)據(jù)點(diǎn)取自文獻(xiàn)[2]的Fig.6等，實(shí)線和數(shù)據(jù)均為擬結(jié)果，虛線為公式(24)的計(jì)算結(jié)果)

式中kc,mix表示混合反應(yīng)的準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)常數(shù)。與文獻(xiàn)中τ=1/k具有權(quán)重加和性不同，目前本文的理論推導(dǎo)，只能得到兩個(gè)互不干擾反應(yīng)的準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)常數(shù)具有權(quán)重加和特性。將文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，作kc～x，結(jié)果也與理論預(yù)測(cè)比較吻合(見(jiàn)圖5)。推斷此結(jié)果可能更為合理，而且其含義也非常明確。但需要經(jīng)過(guò)更多數(shù)據(jù)檢驗(yàn)后方能做出結(jié)論。

按手性超量的定義，即ee=(cR-cS)/(cR+cS) =(2xR-X-1)或xR-X=(ee+1)/2，代入公式(24)中動(dòng)力學(xué)常數(shù)，整理后得：

(25)

該式也與文獻(xiàn)不同，但因未能從文獻(xiàn)測(cè)得相關(guān)原始數(shù)據(jù)，所以該公式也暫時(shí)不能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)，有待以后檢驗(yàn)。如若本公式錯(cuò)誤，則前述關(guān)于魯米諾發(fā)光反應(yīng)機(jī)理的推測(cè)可能還有問(wèn)題，但整個(gè)理論推導(dǎo)思路和基本框架應(yīng)該是可行的。需要注意的是，利用公式(25)時(shí)，要注意溫度對(duì)動(dòng)力學(xué)常數(shù)的影響，欲做可靠和精密測(cè)量，需恒溫在相同的溫度。

3 結(jié) 論

本文根據(jù)文獻(xiàn)所提供的實(shí)驗(yàn)方案，結(jié)合目前金屬鹽或其配合物增敏魯米諾發(fā)光反應(yīng)的機(jī)理，參照色譜運(yùn)行思路，對(duì)CCL進(jìn)行理論推演，得到了一組不同速率反應(yīng)皆可應(yīng)用、有明確理論含義的公式，且其中的關(guān)鍵公式能夠與現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)吻合，并能給予合理詮釋；不過(guò)也有少數(shù)公式與現(xiàn)有推測(cè)不甚相同，雖然理論公式合理性更高，但目前的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證還不夠，尚不能就此作出結(jié)論；另外關(guān)于溫度對(duì)CCL的影響和可利用度，也需要實(shí)驗(yàn)研究和數(shù)據(jù)來(lái)檢驗(yàn)。總體而言，在無(wú)關(guān)于CCL的新理論提出之前，本文所公布的公式是有用價(jià)值的，可以由此推演和開(kāi)發(fā)新的CCL測(cè)定方法，挖掘新的應(yīng)用領(lǐng)域，以及用于指導(dǎo)CCL的進(jìn)一步發(fā)展。此外，本文所公布的理論推導(dǎo)策略對(duì)CCL新理論的推出也有參考價(jià)值。