功能肽段介導的銅離子熒光傳感器的構建及應用

李昕翼，馮富巖，周曉東，胡繼明

(武漢大學 測試中心，湖北 武漢 430072)

銅是人體健康所必要的第三大過渡金屬元素，僅次于鋅和鐵，可在多種生物酶合成過程中作為蛋白的功能輔因子或主要結構組成部分[1]，在細胞呼吸、骨骼發育、結締組織生長等過程中發揮著關鍵作用，是人體必需的微量元素[2-7]。

2.4 新生兒窒息后發生AKI的COX回歸性分析 將尿液減少、Kim-1、Netrin-1、窒息程度納入COX回歸性分析發現，上述因素均與新生兒窒息后AKI發生呈正相關(P<0.05)，見表2。

河北省作為全國加快實施最嚴格水資源管理制度試點之一，為從根本上解決地下水超采問題，按照國家試點工作總體部署，將地下水超采治理作為改善生態環境的三件大事之一，突出重點，抓住關鍵，全力以赴打好超采治理攻堅戰。堅持突出重點、綜合施策、強力推進，重點在“節、引、蓄、調、管”五個方面下功夫、作文章、要效益。按照實行最嚴格水資源管理制度要求和“政府市場協同發力、治理監管同步推進”的思路，凝聚群眾智慧，創新發展模式，總結推廣經驗，敢于碰禁區，敢于先行先試，探索建立有利于水資源可持續利用的體制機制，不斷增強治理地下水超采的內生動力。

美國環境保護署(Environmental Protection Agency，EPA)對飲用水中銅離子的含量限值是1.3 mg/L，正常情況下土壤或地表水中銅離子的含量范圍為0.005～30 μg/L。由于銅離子重要的生理功能及其水平失衡所造成的嚴重病理反應，人們對環境水樣及生物樣品中銅離子含量的檢測進行了諸多研究。Ndokoye等[8]通過Au—S鍵在合成的星狀金納米材料(AuNSs)表面修飾半胱氨酸分子(Cys-AuNSs)，借助銅離子與半胱氨酸分子上氮、氧原子配位引起AuNSs聚集所產生的表面增強拉曼光譜響應信號(SERS)實現了對銅離子的定量檢測。Zhao等[9]設計了一非對稱納米通道/離子通道混合耦合器，基于電化學方法實現了對血液中銅離子的檢測。在該工作中，多孔氧化鋁所提供的納米通道表面修飾了多聚谷氨酸(PGA)，銅離子經過時由于與谷氨酸上的氧、氮原子配位而使通道內的電化學信號發生改變，基于此可實現對銅離子的定量檢測。Liu等[10]利用紅藍雙色碳量子點(CDs)基于特定的光能量轉移設計了銅離子比率熒光檢測試紙，實現了對銅離子的半定量檢測。類似的，硒化鎘量子點也被用于自來水中銅離子的超靈敏檢測[11]。諸如此類的檢測方法不勝枚舉，但對于實際檢測而言均具備一定的局限性。如借助半胱氨酸、多聚谷氨酸與銅離子配位的方法中，氨基酸對金屬離子的選擇性低，在進行實際樣品檢測時其他金屬離子的干擾難以避免。另外，CdSe/ZnS量子點(QDs)、CDs等納米材料的應用，在顯著提高檢測靈敏度的同時也增加了檢測過程的復雜性，檢測中還會存在其他重金屬離子的引入和間接污染。因此，對環境及生物樣品中銅離子的最佳檢測方法尚有待探究。

人們在對因銅離子失衡所引起的相關神經性疾病(如阿爾茲海默癥、帕金森病)[12-13]的研究中發現，淀粉樣蛋白在神經系統中發揮著重要作用，同時淀粉樣蛋白的累積與神經性疾病的相關性也通過一定的轉基因動物模型得到進一步證實[14-15]。相關銅蛋白的多樣結構為對應肽段的設計和篩選提供了充足的資源，例如基于淀粉樣蛋白的Aβ系列肽段。研究發現，多肽分子憑借豐富的結構組成和可變的結構特征，在生物分析、金屬離子檢測等領域表現出巨大的潛力[16-17]。Li等[18]建立了一種基于多肽RFPRGGD-金納米粒子體系快速檢測銀離子的方法。利用多肽中精氨酸與金納米粒子之間的靜電吸力實現多肽的修飾，多肽另一端帶負電的天冬氨酸則會因與金納米粒子之間的靜電斥力起到穩定作用。當銀離子存在時，精氨酸的氨基和天冬氨酸的羧基會與其發生四配位，從而誘導多肽的構象發生折疊，致使金納米粒子團聚，以此實現對銀離子的高效檢測。

為了判斷5條肽段對銅離子親和能力的大小，分別將其與銅離子溶液混合孵育并進行MALDI-TOF MS質譜分析。結合數據發現肽段P5(DDAEGHARHCR)對銅離子表現出較強的親和力，其余肽段也對銅離子表現出一定的親和性，但豐度較低(圖1)。由此，本實驗設計并篩選出多肽P5作為識別銅離子的功能肽段。

2.2.1體系pH值的優化pH值對整個反應體系的影響很大，主要體現在兩個方面，首先就鈣黃綠素而言，不同的環境pH值對其熒光強度有一定的影響，這與鈣黃綠素分子的4個羧基及兩個六元環上的羥基有關；另外，對于多肽分子，不同氨基酸序列肽段的等電點不同(本實驗所設計的肽段等電點為6.49)，在不同的環境酸度下表現的電性有所不同，整個多肽分子的電子密度也有所變化，表現出的與正電荷金屬離子的親和性也有所不同。因此考察了體系pH值對實驗的影響。從圖4A可以發現，在偏酸性的溶液環境下，鈣黃綠素的熒光強度相對較低，這與鈣黃綠素分子內的電子傳導有關，其在pH 7.0左右表現出最強的熒光信號。圖4B是環境pH值對體系熒光恢復效率的影響。在溶液pH值低于或接近多肽分子等電點時，多肽分子呈現正電性或電中性，此時肽段在接近金屬陽離子時會表現出一定的靜電排斥力，該斥力會影響多肽與金屬離子的結合效率；當pH值大于多肽等電點時，肽段整體帶負電，可與金屬陽離子因靜電引力的輔助作用實現更高效的結合，熒光恢復效率上升。綜合鈣黃綠素與多肽分子受pH值的影響情況，以及文獻中對鈣黃綠素溶液的配制方案[22]，確定實驗的最佳pH值為7.0左右。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

滲瀝液產生量受地表降水、地下水以及垃圾自身降解特性的影響，地表水對滲瀝液產生量的影響可以通過雨污分流措施加以控制，而地下水的影響則可以通過防滲襯墊系統加以隔離，但在沒有防滲處理措施的填埋場中，地下水和滲瀝液的影響是相互作用的。對簡易垃圾場的滲瀝液遷移問題，必須首先掌握場區地下水滲流場分布情況，其次分析滲瀝液的擴散路徑與范圍，最終確定柔性垂直防滲墻的合理阻隔位置［3］。

鈣黃綠素、氯化銅、硝酸鋅、氯化鉀、硝酸鈷、氯化鈣、硝酸錳、氯化鐵、氯化鎳、無水乙醇、二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、磷酸均購于北京國藥集團。實驗用多肽(P1：Asp-Ala-Glu-Phe-Gly-His-Ala-Arg-His-Arg；P2：Asp-Asp-Ala-Glu-Gly-His-Ala-Arg-His-Arg；P3：Asp-Asp-Ala-Glu-Phe-Gly-His-Ala-Arg-His-Arg；P4：Asp-Asp-Ala-Glu-Phe-Gly-His-Arg-His-Arg；P5：Asp-Asp-Ala-Glu-Gly-His-Ala-Arg-His-Cys-Arg)由南京杰肽生物科技有限公司合成。10 mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液 (PB);按濃HCl與濃HNO33∶1的體積比配制王水。

1.2 溶液配制

穩定的作物經濟狀況以及良好的種植條件促進了巴西種植的快速開始。有分析師認為未來巴西大豆面積將增加3%至5%，玉米面積將增加5%以上。

用10 mmol/L pH 7.4的PB緩沖溶液配制1 mmol/L的鈣黃綠素溶液，冰箱4 ℃保存。氯化銅標準溶液由超純水配制，并通過梯度稀釋方法稀釋至不同濃度。10 mmol/L不同pH值的PB緩沖溶液配制方法如下：分別配制100 mmol/L的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉溶液100 mL，按不同體積比將兩種磷酸鹽溶液混合均勻，使用pH計檢測緩沖溶液的實際pH值，并通過兩磷酸鹽溶液對pH值進行微調。所得緩沖溶液按1∶10體積比稀釋。

1.3 銅離子檢測

配制0～15 μmol/L的銅離子溶液，鈣黃綠素濃度恒定為80 μmol/L，將不同濃度的銅離子溶液與鈣黃綠素溶液混合5 min，待銅離子反應完全,檢測熒光信號(F1);加入1.5倍物質的量的多肽分子，反應22 min。待反應完全后檢測熒光恢復信號(F2)。取自來水在空氣中靜置2 h，代替銅離子溶液重復上述實驗，檢測自來水中的銅離子含量。取東湖水經0.22 μm濾膜過濾，代替銅離子溶液重復上述實驗，檢測湖水中銅離子的含量。

2 結果與討論

2.1 實驗設計及原理

識別元件的選擇是傳感設計的關鍵。大量文獻證實，基于銅蛋白的功能肽段淀粉樣蛋白肽對銅離子表現出一定的親和性，通過一系列親和系數的計算篩選出的mAβ16肽段(DAEFGHDSGFEVRHQK)具有最高的結合能力[16]。研究表明，由于銅離子體積較小，該肽段與銅離子結合時易發生構型折疊，部分區域相鄰或相間氨基酸可同時與銅離子成鍵。其成鍵原子分別為天冬氨酸(Asp)氨基氮原子、丙氨酸(Ala)羰基氧原子、甘氨酸(Gly)肽鍵氮原子、組氨酸(His)咪唑環內氮原子以及Asp、谷氨酸(Glu)4個氨基酸殘基上的某個羥基氧原子[16]。基于mAβ16肽段與銅離子相互作用的結構特征與配位點，本實驗通過保留二者的作用位點與結合模型，同時更改其余氨基酸的排布方式，設計出5條能與銅離子特異結合的功能肽段，依次命名為P1～P5，具體序列如“1.1”所示。

圖1 P5與銅離子的MALDI-TOF MS質譜圖Fig.1 MALDI-TOF MS spectrum of the mixtures of P5 and Cu(Ⅱ)

本文通過對淀粉樣蛋白肽結構與功能位點的分析，設計并篩選出銅離子高親和性的功能肽段[19-21]。針對早期銅離子對部分熒光素的熒光猝滅作用，選用鈣黃綠素(Calcein)作為熒光探針，借助功能肽段對銅離子的高特異性結合作用并能奪取Calcein-Cu(Ⅱ)的性質，設計了檢測銅離子的熒光恢復型傳感器[22]。通過基體輔助激光解吸電離源-飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)對Cu(Ⅱ)-Peptide 配合物進行了表征分析，并進一步通過質譜分析證實了樣品的選擇性。通過對體系pH值、反應溫度、鈣黃綠素濃度、反應時間等條件的優化，實現了對環境水樣中銅離子的高特異性檢測。

生長過程中所需要的氮元素很大部分由根瘤菌提供，但仍需要從土壤中吸收大量的各種元素供其生長，缺素不僅會造成植株生長差、植株弱化、結莢少、病害多、病害重，導致產量低。不同生育期所吸收的養分數量也有所不同。其生長前期需肥量較少，花莢結實期，吸收養分的數量最多，此期所吸收的氮元素占全生育期的48%，磷占60%，鉀占46%。此階段養分不足，會造成減產減質。尤其是缺乏鉀、磷元素的供應，會造成嚴重的減產。另外，在適時適量的滿足蠶豆對氮、磷、鉀三大主肥需求的同時，還要及時補施硼、鉬等微肥，以確保產量和品質。

圖2 鈣黃綠素-多肽體系熒光檢測銅離子的傳感原理圖(A)和反應前后的熒光變化(B)Fig.2 Schematic diagram of fluorescence-based calcein-peptide assay for Cu(Ⅱ)(A)and fluorescence signals change(B)

為了考察方法的可行性，通過MALDI-TOF MS分析了Na(Ⅰ)、Mg(Ⅱ)、K(Ⅰ)、Ca(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)、Co(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)9種常量、微量金屬元素與多肽分子的親和性。一定量的多肽分子與相當物質的量的9種金屬離子混合液孵育60 min，質譜數據如圖3A所示。9種金屬離子和肽段均無可識別性的配位結合。當向金屬離子混合液中加入銅離子時，可發現明顯的分子離子峰(圖3B)，且相對豐度較高，說明該肽段與銅離子結合具有很強的靶向性和親和性。鈣黃綠素作為鈣的指示劑與鈣離子結合較為穩定，且不能通過EDTA(乙二胺四乙酸)掩蔽，為此考察了鈣離子對體系的干擾情況。如圖3C和圖3D所示，在鈣黃綠素溶液中加入等物質的量的鈣離子，熒光強度有20%的增加，在該體系中繼續加入等物質的量的銅離子，熒光很快猝滅，說明鈣離子的加入不會干擾Calcein-Cu(Ⅱ)的生成。隨后在該溶液中加入多肽分子，熒光逐漸恢復。結合多肽與鈣黃綠素的濃度比估算得到熒光恢復率為80%，說明鈣離子的引入并未造成明顯的干擾。由此可見，肽段的設計成功地避免了鈣黃綠素與其他金屬離子結合致使熒光強度改變而對體系造成的干擾，同時Cu2+之處的其他金屬離子與鈣黃綠素的結合未對多肽配位效率產生影響，說明該方法具有較好的選擇性。

2.2 實驗參數的優化

黃庭堅(1045-1105)，字魯直，號山谷道人，晚號涪翁，洪州分寧（今江西修水縣）人。宋英宗治平四年（1067）中進士，時年22歲。歷官縣尉、知縣、知州、校書郎、秘書丞、國史館編修等。與蘇軾亦師亦友，以詩與書法聞名。

熒光分光光度計(F-4600，日本日立公司)，紫外-可見吸收光譜儀(UV-2550，日本島津公司)，超純水儀(Millipore Direct-Q3，德國默克密理博公司)，MALDI-TOF MS質譜儀(AB 5800，美國愛博才思公司)。

本實驗的設計原理是基于Cu(Ⅱ)對鈣黃綠素(Calcein)的熒光猝滅作用，借助功能肽段特異性捕獲銅離子而使熒光恢復來檢測Cu(Ⅱ)。鈣黃綠素是一種橙黃色固體粉末，溶于水呈黃色并顯綠色熒光，遇銅離子熒光猝滅。由于鈣黃綠素可與多種金屬離子結合，使得其他金屬離子對檢測體系干擾嚴重。本文創新性地設計了可對銅離子特異性結合的肽段，實現了對Calcein-Cu(Ⅱ)配合物中Cu(Ⅱ)的捕獲，鈣黃綠素作為可化學發光的熒光分子將在肽段奪取銅離子后恢復熒光。根據熒光恢復強度差值(F2-F1)即可實現對銅離子的特異性定量檢測(圖2)。

2.2.2反應溫度的優化一般情況下，溫度主要影響化學反應的速率。本實驗對反應溫度的優化主要考慮兩個因素：一是鈣黃綠素的熒光信號會因分子碰撞等因素發生猝滅，因此反應溫度不宜過高；二是多肽作為生物分子，需具備合適的溫度環境，較低的環境溫度將直接影響肽段與金屬配位的化學反應效率。如圖4C所示，鈣黃綠素低溫下的熒光強度相對較低，在25 ℃時熒光響應信號最高，繼續升溫至30 ℃時存在一定的分子熒光猝滅。多肽分子的熒光恢復效率受溫度的影響如圖4D所示，其在20～25 ℃范圍內的熒光恢復效率最高。結合鈣黃綠素分子自身熒光強度受溫度的影響情況，選定25 ℃為最佳反應溫度。

2.2.3鈣黃綠素濃度的優化對濃度分別為10-7～10-3mol/L的鈣黃綠素溶液進行熒光分析，結果如圖4E所示。在鈣黃綠素濃度低于10-5mol/L時，熒光響應信號較低。當濃度大于10-4時熒光信號出現一定程度的自猝滅且熒光發射光譜出現了一定程度的藍移(藍移原因尚未查明)。當鈣黃綠素的濃度保持在10-5～10-4mol/L時，溶液表現出最高的靈敏度。因此后續實驗選擇鈣黃綠素檢測的最終濃度為10-5～10-4mol/L范圍。

2.2.4反應時間的優化本實驗中，鈣黃綠素分子結合銅離子的熒光猝滅瞬間發生，這與分子間的能量傳遞有關。由于與銅離子間較強的親和性，多肽分子會奪取calcein-Cu(Ⅱ)配合物中的Cu(Ⅱ)形成peptide-Cu(Ⅱ)配合物，鈣黃綠素分子被釋放因而熒光信號恢復。考察了肽段加入后的反應動力學，以熒光強度作為參考值，以2 min 為取樣間隔，采集每個時間點的熒光恢復數據，結果如圖4F所示。發現22 min時熒光達到最大值，并在20～25 min前后保持相對穩定。因此確定肽段奪取Cu(Ⅱ)的穩定時間為22 min。

2.3 銅離子的檢測

在優化條件下，考察了不同濃度的Cu(Ⅱ)對鈣黃綠素溶液的熒光猝滅作用，平行測定3組。銅離子與鈣黃綠素反應迅速，將銅離子溶液加入到鈣黃綠素溶液中反應5 min后檢測該Cu(Ⅱ)-calcein體系的熒光強度，發現隨著銅離子濃度的增加熒光強度逐漸降低(圖5)，說明隨著銅離子濃度的升高，發生熒光猝滅的calcein-Cu(Ⅱ)配合物逐漸增加，并得到隨Cu(Ⅱ)濃度(x)變化鈣黃綠素熒光強度(y)梯度降低的標準曲線為:y=-248.45x(μmol/L)+3 994.12，相關系數R2=0.998。由于鈣黃綠素可與多種金屬離子結合產生熒光增強或猝滅，進行實際檢測時，生活用水中的Ca(Ⅱ)、Mg(Ⅱ)等離子均會對其熒光強度產生干擾。本實驗引入的對Cu(Ⅱ)具有特異性捕獲功能的肽段P5可使熒光恢復到一穩定值。基于熒光強度恢復的平均值F2與相應的各銅離子濃度(x)對應的熒光強度猝滅值F1的差值(y)，構建的銅離子檢測的標準曲線為：y=249.42x(μmol/L)+470.36，線性范圍為0.12～13 μmol/L(R2=0.995)，檢出限為127 nmol/L。

圖5 不同銅離子濃度下鈣黃綠素-銅離子體系的熒光光譜圖Fig.5 The fluorescence spectra of calcein-Cu system in different concentrations of Cu(Ⅱ)

根據國家環境安全標準中Cu(Ⅱ)的限定濃度1 mg/L(15.74 mmol/L，EPA標準)，該方法可滿足日常生活用水及環境水中銅離子的定量檢測要求。基于本文建立的方法，將加標處理后的自來水及湖水實際樣品按照Cu(Ⅱ)標準溶液檢測方法加入到鈣黃綠素溶液中，保持5 min，檢測其熒光信號F1，加入肽段22 min后檢測其熒光信號F2，根據熒光恢復情況實現了對水樣中銅離子檢測，結果見表1。為了證實方法的準確性，通過原子吸收光譜法(AAS)進行驗證。AAS法所得結果與本實驗方法基本吻合(表1)，說明該方法具有較好的實用性。

表1 實際樣品中銅離子檢測數據Table 1 The results of Cu(Ⅱ) detection in practical samples

3 結 論

本工作設計了一種基于特定多肽的熒光恢復型銅離子生物傳感器。依據生物體內淀粉樣蛋白與Cu(Ⅱ)的特異性作用，設計了一系列可與Cu(Ⅱ)靶向作用的功能肽段P5。該肽段可快速奪取Calcein-Cu(Ⅱ)絡合物中的Cu(Ⅱ)并與其形成穩定的配合物，同時促使Calcein熒光信號恢復，從而實現對Cu(Ⅱ)的定量檢測。方法成功避免了其他金屬離子對銅離子檢測的干擾，改善了已有報道中氨基酸熒光信號恢復而伴隨的熒光穩定性差且選擇性低等局限，增加了檢測的準確度與可靠性。該方法簡單、快速、穩定、選擇性強，線性范圍為0.12～13 μmol/L，檢出限為127 nmol/L，可滿足地表水及生活用水的正常檢測要求。