磁免疫結合單顆粒模式ICP-MS同時測定乳腺癌病人血清中的CEA與CA15-3

何永昱，曹玉嬪，覃東廟，鄧必陽*

(1.廣西師范大學 化學與藥學學院 省部共建藥用資源化學與藥物分子工程國家重點實驗室,廣西 桂林 541004；2.廣西中醫藥大學 藥學院，廣西 南寧 530200)

癌癥是當今世界上最致命的疾病之一[1]。癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)是一種糖蛋白，是多種癌癥中最重要的腫瘤標志物之一。目前，CEA已被證實與結直腸癌有關，并被認為是乳腺癌、卵巢癌和口腔癌的重要生物標志物[2-5]。糖類抗原15-3(Carbohydrate antigen 15-3,CA15-3)是一種來自muc1家族的400 kDa糖蛋白，也是一種與乳腺癌高度相關的生物標志物，常用于乳腺癌患者的早期診斷、進展和復發診斷[6-7]。但檢測單個CEA或者CA15-3存在準確度不高的局限性，同時檢測CEA和CA15-3可更大程度地提高相關癌癥早期診斷準確性。目前已報道用于檢測腫瘤標志物的方法有酶聯免疫分析(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)[8]、放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)[9]、電化學免疫分析(Electrochemical immunoassay,ECIA)[10]、化學發光免疫分析(Chemiluminescence immunoassay,CLIA)[11]和電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)[12-20]等。ICP-MS與元素標記相結合已成為一種極具潛力的腫瘤標記物檢測方法，尤其是在大規模生物檢測和臨床診斷中具有多重分析的潛力[13]。納米粒子由于粒徑小、表面容易修飾、生物兼容性好等優點，在生物標記研究中呈現良好的應用前景[21-22]。等離子體離子化過程中離子放電產生的時間分辨瞬態信號可以反映納米粒子的濃度，因此，可通過瞬態信號頻率量化納米粒子標記免疫復合物的濃度[13]，已有多種金屬納米顆粒用于ICP-MS的生物分析[12-20]。上轉換納米粒子(Upconversion nanoparticles，UCNPs)因具有良好的生物相容性和化學穩定性已廣泛應用于生物標記、生物傳感和細胞檢測[23]。CeO2-SiO2NPs中的140Ce原子在ICP-MS檢測中幾乎不受分子離子的光譜干擾，并具有較低的背景[24]。如Yang等[20]報道了一種多功能探針應用于ICP-MS測定和癌細胞的多模態成像的方法;Choi等[23]報道了基于ICP-MS的氧化鈰沉積的介孔氧化硅納米顆粒用于檢測人血清中癌胚抗原的方法;Liu等[24]報道了上轉換納米顆粒標記結合ICP-MS測定人血清中甲胎蛋白的方法。目前，尚未見基于UCNPs和CeO2-SiO2NPs標記ICP-MS單顆粒模式同時測定人血清中CEA和CA15-3的報道。

本研究通過自主合成羧基功能化上轉化納米顆粒(UCNPs)和氨基功能化二氧化鈰沉積的二氧化硅納米顆粒(CeO2-SiO2NPs)，并將其用于免疫標記檢測抗體。同時還制備了具有良好分散性和水溶性的氨基功能化四氧化三鐵磁納米顆粒(Amino modified magnetic nanoparticles，AMNPs)，用于包被抗體和高效快速的磁分離。夾心免疫反應完成后，用甲酸洗脫夾心免疫復合物，通過ICP-MS單顆粒模式同時檢測納米顆粒中的140Ce和174Yb，間接測定了CEA和CA15-3，并成功應用于乳腺癌病人血清中CEA和CA15-3的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

NexIon 300 X型ICP-MS(美國PerkinElmer公司)，工作參數：射頻功率(RF power)為1 300 W；輔助氣流速(Auxiliary gas flow)為1.2 L·min-1；等離子體流速(Plasma gas flow)為15 L·min-1；RPq為0.8；掃描方式(Scan mode)為跳峰(Peak hopping)；駐留時間(Dwell time)為0.1 ms；Sweeps為1；監測同位素(Monitored isotope)(m/z)為140Ce和174Yb。Spectrum Two FT-IR紅外光譜儀(美國PerkinElmer公司)。Rigaku D/max 2500/pc型X射線粉末衍射儀(日本理學)。JEM-2100透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)。TG16-W微量高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)。DZF-300真空干燥箱(鄭州長城科工貿有限公司)。

N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl，98%)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、六水合氯化鐵、乙二醇、無水醋酸鈉、正硅酸乙酯(TEOS)、介孔二氧化硅納米顆粒、六水合硝酸鈰、聚氧代乙烯壬基苯基醚(IGEPAL CO-520)、3-氨丙基三甲氧基硅氧烷(APTMS)、三氧化鐿、三氧化釔、三氧化鉺、濃硝酸、甲酸、聚丙烯酸(PAA)和NaF均購于阿拉丁試劑公司(上海)。牛血清白蛋白(BSA)購于美國Sigma-Aldrich公司。癌胚抗原(CEA)、糖類抗原15-3(CA15-3)、鼠源CEA抗體(Mouse anti-CEA)、兔源CA15-3抗體(Rabbit anti-CA15-3)和純化抗體IgG購于北京博奧森生物技術有限公司。無水乙醇、氨水、磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀(西隴化工股份有限公司)。質譜調諧液(1 ng·mL-1)包括Be、Mg、In、U、Ce混合標準液(美國PerkinElmer公司)。以上試劑均為分析純。實驗用水均為高純水。

1.2 氨基功能化Fe3O4磁納米粒子的制備

Fe3O4納米粒子(Magnetic nanoparticles，MNPs)的制備參考文獻[25]并稍作修改：稱取1.35 g FeCl3·6H2O和3.60 g無水醋酸鈉溶于40 mL乙二醇，超聲分散15 min，充分攪拌15 min，將混合溶液放入壓力釜中，于200 ℃反應12 h，磁分離，用水和乙醇交替洗滌4次，得Fe3O4磁納米粒子。將Fe3O4磁納米粒子重新分散于80 mL乙醇和20 mL水中，加入2 mL氨水，超聲分散5 min。再加入1 mL TEOS，攪拌下反應24 h,磁分離，用水和乙醇洗滌。再將Fe3O4磁納米粒子分散于50 mL乙醇和50 mL水中，超聲分散均勻，加入2 mL APTES，60 ℃攪拌反應24 h，磁分離，用水和乙醇交替洗滌6次，得到氨基功能化的Fe3O4磁納米粒子(AMNPs)。于70 ℃真空干燥4 h，備用。

1.3 氨基功能化CeO2-SiO2NPs的制備

氨基功能化CeO2-SiO2NPs的制備參考文獻[23]并稍作修改：稱取0.250 g SiO2超聲分散于20 mL乙醇中，加入20 mL 乙醇、0.500 g Ce(NO3)3·6H2O和1 mL IGEPAL CO-520，攪拌反應1 h，向混合液中加入20 mL乙醇和0.050 mL NH4OH。8 000 r/min離心5 min，收集沉淀膠體，置于烘箱中干燥。將收集的膠體于500 ℃ 煅燒5 h，制得CeO2沉積二氧化硅納米顆粒。稱取0.001 g CeO2沉積二氧化硅納米顆粒超聲分散于2 mL乙醇中，加入100 μL APTMS，攪拌反應3 h，用乙醇離心洗滌4次，制備得氨基功能化CeO2-SiO2NPs。

1.4 羧基功能化UCNPs的合成

上轉換納米顆粒合成參考文獻[24]并稍作修改：將2.260 g Y2O3、0.890 g Yb2O3和 0.096 g Er2O3溶于65 ℃濃硝酸，加熱至140 ℃，蒸發溶劑，再重新分散至100 mL水中，制得鑭系儲備液，備用。將0.900 g PAA溶解于2 mL鑭系儲備液，倒入反應容器中，再向其中加入8 mL水、18 mL乙醇和0.210 g NaF，充分攪拌20 min，置于200 ℃反應10 h，冷卻至室溫，用乙醇和水離心分離洗滌3次，制得羧基功能化UCNPs，將其分散于水中，備用。

1.5 CeO2-SiO2NPs-Ab2-CEA偶聯物的制備

準確稱取0.001 g CeO2-SiO2NPs分散于1 mL PBS緩沖溶液中，超聲分散5 min。加入0.050 g EDC和0.050 g NHS，緩慢攪拌反應24 h，活化氨基。以8 000 r/min離心5 min，再用PBS洗滌3次，分散于1 mL PBS中，于4 ℃保存備用。準確移取200 μL上述活化的CeO2-SiO2NPs納米顆粒溶液，置于1 mL PBS中，向其中加入10 μL CEA的檢測抗體(Ab2-CEA)，緩慢攪拌反應2 h。再以8 000 r/min離心5 min，用PBS洗滌3次，以除去未結合的Ab2-CEA，收集得CeO2-SiO2NPs-Ab2-CEA。為封閉非特異性吸附位點，加入100 μL 2% BSA反應1 h。8 000 r/min離心5 min，用PBS 洗滌3次，最后分散于1 mL PBS中，于4 ℃保存備用。

1.6 UCNPs-Ab2-CA15-3偶聯物的制備

準確稱取0.001 g羧基功能化UCNPs，分散于1 mL PBS緩沖溶液中，超聲分散5 min，加入0.050 g EDC和0.050 g NHS，緩慢攪拌反應24 h，活化羧基。以8 000 r/min離心5 min，再用PBS洗滌3次，分散于1 mL PBS中，4 ℃保存備用。準確移取200 μL上述溶液，用PBS稀釋至1 mL，將10 μL CA15-3的檢測抗體(Ab2-CA15-3)加入上述納米顆粒溶液中，緩慢攪拌反應2 h。以8 000 r/min離心5 min，用PBS洗滌3次，除去未結合的檢測抗體，收集得UCNPs-Ab2-CA15-3。為了封閉非特異性吸附位點，再加入100 μL 2% BSA反應1 h。8 000 r/min離心5 min，用PBS 洗滌3次，最后分散于1 mL PBS中，于4 ℃保存備用。

1.7 磁免疫反應過程

磁免疫反應流程如圖1所示。準確稱取0.020 g AMNPs，分散于10 mL PBS中，超聲10 min使磁納米粒子均勻分散，向其中加入0.060 g EDC和0.060 g NHS，活化氨基，室溫輕輕振蕩反應2 h，磁分離，用PBS洗滌3次。將AMNPs分散于2 mL PBS中，分別加入10 μL CEA包被抗體(Ab1-CEA)和10 μL CA15-3包被抗體(Ab1-CA15-3)，室溫輕輕振蕩反應2 h，磁分離，PBS洗滌3次除去未反應的Ab1，AMNPs完成捕獲包被抗體，得到AMNPs-Ab1。加入600 μL 1% BSA反應1 h，以封閉非特異性吸附位點，磁分離，PBS洗滌3次，重新分散于15 mL PBS中,4 ℃保存備用。每次使用前超聲5 min使納米顆粒均勻分散在溶液中。

圖1 磁免疫反應流程圖Fig.1 Schematic diagram of magnetic immunoassay

準確移取0.5 mL AMNPs-Ab1，加入40 μL CEA和CA15-3混合溶液或人血清樣品，37 ℃恒溫振蕩孵育1 h，磁納米粒子捕獲的包被抗體與抗原完成特異性結合。磁分離，PBS洗滌3次。分別加入50 μL CeO2-SiO2NPs-Ab2-CEA和40 μL UCNPs-Ab2-CA15-3，37 ℃溫和振蕩孵育1 h，完成抗原抗體特異性結合，形成雙抗夾心免疫復合物。磁分離，用PBS洗滌6次。再用500 μL 1.5 mol·L-1甲酸洗脫雙抗夾心免疫復合物，80 ℃下反應20 min，冷卻至室溫，超聲15 min，使納米顆粒從復合物中完全洗脫，磁分離，再將洗脫液定容至8 mL，采用ICP-MS的單顆粒模式檢測納米顆粒中的140Ce和174Yb。

2 結果與討論

2.1 氨基功能化Fe3O4 磁納米粒子的表征

采用透射電子顯微鏡(TEM)和紅外光譜(FT-IR)表征合成的氨基功能化Fe3O4磁納米粒子。結果顯示，制備的納米顆粒呈圓形，具有較好的分散性(圖2A)；尺寸分布統計圖顯示AMNPs的平均粒徑約42 nm(圖2B)；FT-IR圖可見，582 cm-1處為Fe—O鍵特征吸收峰，1 076 cm-1處為Si—O—Si的特征吸收峰，1 390 cm-1和1 634 cm-1處為磁納米粒子表面上有游離的氨基特征峰(圖2C)[26]，表明氨基已成功修飾到Fe3O4磁納米顆粒上。

圖2 AMNPs的透射電子顯微鏡圖(A)、尺寸分布圖(B)和紅外光譜圖(C)Fig.2 TEM image(A),size distribution image(B) and FT-IR spectra(C) of AMNPs

2.2 氨基功能化CeO2-SiO2NPs的表征

合成的氨基功能化CeO2-SiO2NPs的透射電子顯微鏡圖、尺寸分布圖及紅外光譜圖見圖3，結果顯示，CeO2-SiO2NPs具有較好的分散性(圖3A)，平均粒徑約35 nm(圖3B)，1 619 cm-1處為—NH2特征吸收峰(圖3C)，表明APTMS已成功修飾到二氧化鈰沉積介孔二氧化硅納米顆粒表面。

圖3 CeO2-SiO2NPs的透射電子顯微鏡圖(A)、尺寸分布圖(B)和紅外光譜圖(C)Fig.3 TEM image(A),size distribution image(B) and FT-IR spectrum(C) of CeO2-SiO2NPs

2.3 羧基功能化UCNPs的表征

圖4 UCNPs的透射電子顯微鏡圖(A)、X射線粉末衍射圖(B)和紅外光譜圖(C)Fig.4 TEM image(A),XRD spectrum(B) and FT-IR spectrum(C) of UCNPs

2.4 ICP-MS干擾的消除

174Yb的自然豐度為31.80%，易受到174Hf、158Gd16O和158Dy16O的干擾。140Ce的自然豐度為88.84%，不受同質量數原子和多原子分子的干擾[27]。因此,實驗考察了乳腺癌病人血清樣品和PBS緩沖溶液中Hf、Gd和Dy的含量。結果表明，乳腺癌病人的血清樣品和PBS緩沖溶液均不含有Hf、Gd和Dy，因此,174Hf、158Gd16O和158Dy16O對174Yb的信號干擾可忽略。

圖5 駐留時間對140Ce和174Yb的信號頻數的影響Fig.5 Effects of dwell time on the number of detection events of 140Ce and 174Yb

2.5 SP-ICP-MS條件的優化

單顆粒ICP-MS中，為使每個瞬態信號對應一個粒子，駐留時間影響很大[12]。實驗考察了駐留時間對收集納米顆粒瞬態信號頻數的影響(圖5)。結果顯示，當駐留時間為0.1 ms時，收集到的Ce和Yb納米顆粒信號頻數最大，由于團聚或多個納米顆粒同時進入檢測器的影響，隨著駐留時間的增大，收集到的納米顆粒瞬態信號頻數逐漸減少，因此最終選擇駐留時間為0.1 ms。實驗還考察了CeO2-SiO2NPs濃度對顆粒信號頻數的影響，發現當CeO2-SiO2NPs濃度大于25 ng·mL-1時，收集到的納米顆粒(Ce)瞬態信號頻數幾乎不會再變化，因此CeO2-SiO2NPs的最佳濃度為25 ng·mL-1。另外，UCNPs濃度對顆粒信號頻數也有影響，其濃度大于10 ng·mL-1時，可能是由于濃度過大造成顆粒團聚，使得導致收集到的納米顆粒(Yb)信號頻數幾乎不再變化，所以UCNPs最佳濃度設為10 ng·mL-1。

2.6 磁免疫反應條件的優化

為獲得最佳的捕獲效率，實驗考察了AMNPs-Ab1的體積對顆粒信號頻數的影響。結果顯示，當AMNPs-Ab1體積由100 μL增加到500 μL時，140Ce和174Yb的信號頻數逐漸增多，當AMNPs-Ab1體積大于500 μL時，140Ce和174Yb收集到的信號頻數幾乎不再變化，因此選擇AMNPs-Ab1體積為500 μL。

納米顆粒與檢測抗體的偶聯物是免疫分析的關鍵因素。為確保CeO2-SiO2NPs-Ab2-CEA和UCNPs-Ab2-CA15-3與抗原完全反應，需加入過量的CeO2-SiO2NPs-Ab2-CEA和UCNPs-Ab2-CA15-3，但隨著濃度升高也會導致非特異性吸附的背景強度增大。因此實驗考察了CeO2-SiO2NPs-Ab2-CEA和UCNPs-Ab2-CA15-3體積對顆粒信號頻數的影響。結果發現，140Ce和174Yb的信號頻數隨著CeO2-SiO2NPs-Ab2-CEA和UCNPs-Ab2-CA15-3的體積在10～50 μL范圍內增大而逐漸增大，當CeO2-SiO2NPs-Ab2-CEA和UCNPs-Ab2-CA15-3的體積均大于50 μL時，納米顆粒信號頻數不再改變(圖6A)。因此，確定CeO2-SiO2NPs-Ab2-CEA和UCNPs-Ab2-CA15-3的最佳體積為50 μL。另外，實驗考察了磁免疫反應的孵育時間對納米顆粒信號頻數的影響。結果顯示，140Ce和174Yb的信號頻數隨著孵育時間在20～60 min范圍內增大而逐漸增大，60 min后幾乎不再改變(圖6B)，因此，選擇孵育時間為60 min。為了封閉非特異性吸附位點，實驗選擇含1% BSA的PBS溶液為封閉劑，并考察了BSA體積對非特異性吸附的影響。實驗流程如圖1所示，用PBS代替CEA和CA15-3抗原，收集磁免疫反應吸附后的殘留液，發現當BSA體積從100 μL增至600 μL時，140Ce和174Yb的信號頻數逐漸增多，當BSA體積大于600 μL時，140Ce和174Yb的信號頻數幾乎不再變化(圖6C)。說明非特異性吸附隨著BSA體積的增加而降低。因此BSA的最佳體積為600 μL。

2.7 線性范圍與檢出限

在優化實驗條件下，對建立方法的分析性能進行評估。結果顯示，CEA和CA15-3的脈沖頻率(Y)與其濃度(X)分別在0.02～100 ng·mL-1和0.05～50 U·mL-1范圍內呈良好線性，線性方程分別為Y=7.380X+24.69(r2=0.994 0)和Y=9.850X+29.33(r2=0.987 0)，以3倍信噪比(S/N=3)計算得兩者的檢出限(LOD)分別為0.006 7 ng·mL-1和0.016 7 U·mL-1。本方法的檢出限優于其他免疫分析方法(表1)[19,28-32]。

表1 多種分析方法的比較Table 1 Comparison of various analytical methods

2.8 實際樣品分析

在優化條件下，采用磁免疫反應結合納米粒子標記單顆粒模式ICP-MS測定3名乳腺癌病人血清中CEA和CA15-3含量，并進行加標回收實驗，結果見表2。結果顯示，3名乳腺癌病人血清中均檢出CEA和CA15-3CEA在3名乳腺癌病人血清中的加標回收率為95.2%～98.9%，相對標準偏差(RSD)為3.0%～4.6%；CA15-3的回收率為95.5%～97.2%，RSD為3.4%～4.3%，表明方法具有較好的準確性和精確度，該結果與臨床使用的化學發光免疫方法結果一致，可用于實際血清樣品中CEA和CA15-3含量的測定。

表2 乳腺癌病人血清樣品的分析結果(n=5)Table 2 Analytical results of breast cancer human serum samples(n=5)

3 結 論

本文建立一種以UCNPs和CeO2-SiO2NPs為標簽的磁免疫反應結合SP-ICP-MS同時測定乳腺癌病人血清中CEA和CA15-3的新方法。方法具有通過多種元素標記同時定量檢測多種生物樣品中低濃度糖蛋白的潛力，表明基于金屬納米粒子標記的SP-ICP-MS方法在生物醫學研究和臨床診斷中具有潛在的應用價值。