活血接骨方對骨髓間充質干細胞成骨分化中Wnt信號通路及Sclerostin基因的影響＊

俞云飛，王建偉，馮 驊，尹 恒，華 臻，吳 毛

(無錫市中醫醫院骨科 無錫 214000)

1 引文

骨折作為以骨小梁損傷斷裂為病理特征的臨床疾病，骨折愈合是指骨折處連續性組織修復，而骨組織的修復重建涉及多種組織和細胞參與，其中干細胞來源的骨組織重建是骨折修復的重要組成部分，骨髓則是干細胞的主要來源。骨髓間充質干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)也稱骨髓基質干細胞(bone marrow stromal cell，MSC)是骨髓內存在的一類非造血干細胞，當機體發生骨折時，在局部微環境的誘導刺激下，向骨折處聚集、遷移，誘導并分化成為成骨細胞參與骨組織修復與重建?，F代研究表明[1]，BMSCs可以在多種生物信號因子及信號通路的調控下參與骨代謝過程。骨形態發生蛋白(BMP)屬于轉化生長因子β(TGF-β)超家族，包括BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-9等具有骨誘導活性的生物因子，被證實可以通過Smad、Wnt等骨代謝相關信號通路參與調控BMSCs介導的骨修復過程[2]。

Sclerostin也稱骨硬化蛋白/硬骨素，作為骨細胞和軟骨細胞特異性表達的分泌性蛋白，早期研究中被當做BMP抑制劑，通過調節Smad信號通路參與骨代謝形成過程。近期研究表明[3]，Sclerostin主要通過阻礙Wnt信號通路激活，而非既往認為的抑制Smad通路調控骨代謝過程。國外有學者發現[4]，Sclerostin基因敲除小鼠中骨量明顯增加，而過表達小鼠出現骨量減少、成骨細胞數量減少等趨勢。在對BMSCs細胞的相關研究中發現[5]，Sclerostin不僅可以抑制BMSCs的成骨分化過程，還可以減弱BMSCs細胞增殖活性及鈣化作用，對骨形成起負性調控作用。目前已證實，經典Wnt信號通路是調節BMSCs成骨分化的重要途徑，該途徑的激活可促進成骨細胞分化與細胞礦化現象發生。

“劉氏骨傷”作為無錫市非物質文化遺產，主張以中醫手法為主、內服外敷為輔，要求內外兼治、動靜結合[6]。多年來經多代傳人總結、完善形成的我科經驗方—活血接骨方，臨床驗證具有良好的治療效果[7-9]，但其中的作用機制仍不十分明確。祖國醫學一般將其歸屬到“骨折病”范疇，并且與瘀血關系密切[10]。有研究表明[11,12]，活血接骨類中藥湯劑可以通過拮抗環氧化酶2(COX-2)抑制劑，促進上調BMP-2及骨鈣素(OC)基因表達并增強成骨細胞活性，從而參與并促進骨折早期愈合過程?！袄m骨活血湯”作為中醫傳承經驗方，主要功效活血祛瘀，止痛續骨，在治療促進骨折愈合取得良好的臨床療效。我們前期研究發現，通過siRNA抑制Sclerostin基因可以促進BMSCs體外成骨分化過程[13]。在此基礎上，本研究依托無錫市科教強衛項目(編號：ZDRC025)，以BMSCs為研究對象，設計完整實驗，探究在成骨誘導條件下，活血接骨方對BMSCs體外成骨分化過程中Sclerostin基因及Wnt信號通路的影響，揭示活血接骨方促進骨折愈合的可能作用機制。

2 材料與方法

主要試劑和儀器：DMEM(Hyclone，美國)；胎牛血清(GlBICO，美國)；胰蛋白酶(Sigma，美國)；CCK-8試劑盒(Abcam，美國)、茜素紅(Sigma，美國)；總蛋白提取試劑盒(上海碧云天公司，中國)；一抗：Col1A2(貨號ab96723，稀釋比例1∶500)、OC(貨號ab13420，稀釋比例1∶500)、OPN(貨號ab8448，稀釋比例1∶1000)、Sclerostin(貨號ab63097，稀釋比例1∶1000)、Wnt5a(貨號ab72583，稀釋比例1∶1000)、GSK-3β(貨號ab227208，稀釋比例1∶500)、P-GSK-3β(貨號ab75745，稀釋比例1∶500)及GAPDH(貨號ab9485，稀釋比例1∶2500)均為美國Abcam公司產品。二抗：山羊抗兔抗體(貨號7074，稀釋比例1∶2500)和馬抗小鼠抗體(貨號7076，稀釋比例1∶2500)為美國CST公司產品；NanoDrop 2000(Thermo＆Scintific，美國)；細胞計數儀和Trizol(Invitrogen，美國)；實時PCR試劑盒(TOYOBO，中國)；實時PCR儀(RocheLightCycler480，德國)；PCR反應體系和反轉錄試劑盒(Fermentas，美國)；SDSPAGE凝膠配制試劑盒和ECL發光液(上海碧云天公司，中國)。

2.1 活血接骨方含藥血清制備

活血接骨方組成：主要成分包括地鱉蟲、血竭、川芎、川斷、乳香、沒藥、白術、丁香、杜仲、骨碎補、黨參、當歸、黃芪、自然銅、熟地、蘇木等藥物組成等。無錫市中醫醫院藥劑室制備，使用0.9%氯化鈉配置成終濃度為0.45 g·mL-1生藥，再經過瓶裝、封蓋、滅活，置于4℃冰箱保存。取與中藥湯劑相同劑量的0.9%氯化鈉溶液配置成對照溶液。

活血接骨方含藥血清制備：取體重為200-250 g SD大鼠10只，依據《藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算》計算實際大鼠灌藥劑量，空白血清組給予等量生理鹽水。每天于8點、20點分別灌服中藥或生理鹽水1次，連續7天，第7天上午8點灌注全天量，灌服后1 h后于下腹主動脈采血，經靜置、離心、滅活補體、過濾除菌等步驟制得，分裝并標記含中藥血清和空白血清，放置于-20℃保存備用。

2.2 BMSCs分離與培養

分離：取體質量100-150 g SD大鼠，采取頸斷法處死后75%乙醇浸泡消毒，剝離并折斷脛骨及股骨，用含雙抗PBS液(終濃度為青霉素100 U·mL-1和鏈霉100μg·mL-1)沖洗出骨髓細胞，離心去上清液、PBS重懸，細胞計數。

培養：按1×105個·cm-2密度將細胞均勻接種于MGM培養基，加入10%FBS、1%雙抗，37℃、5%CO2環境的恒溫箱中培養，3天換液1次，繼續培養7天后收集細胞，取部分用于實驗，部分液氮冷藏保存。

2.3 BMSCs成骨分化誘導

將BMSCs按1×105個·cm-2密度接種于6孔板中，使用含MGM培養基的成骨誘導液(100 nmol·L-1地塞米松、10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉、50 mg·L-1抗壞血酸)培養24 h后進行試驗。依據干預培養條件分為4組：對照組(含10%空白大鼠血清)、中藥組(10%含藥大鼠血清)、BMP-4組(含0.1 ug·mL-1BMP-4)，中藥+BMP-4組(10%含藥大鼠血清+0.1 ug·mL-1BMP-4)，3天換液1次，共培養28天。采用CCK-8檢測細胞活性；采用實時熒光PCR和Western Blot檢測成骨分化相關分子(Col1A2、OC、OPN)及Sclerostin基因的mRNA和蛋白水平表達情況；采用ALP和茜素紅染色檢測細胞礦化程度。

2.4 中藥含藥血清對Wnt信號通路的濃度依賴性研究

將BMSCs按1×105個·cm-2密度接種于六孔板培養皿，依據培養血清濃度分4組：空白對照組(含10%空白大鼠血清)、低濃度組(5%含藥血清)、中濃度組(10%含藥血清)、高濃度組(含20%含藥血清)，最終使用空白大鼠血清調配使各組最終大鼠血清終濃度為20%，3天換液1次，共培養7天。采用CCK-8檢測細胞活性；采用實時熒光PCR和Western Blot檢測Sclerostin基因和Wnt信號通路相關分子(Wnt5a、GSK-3β)的mRNA和蛋白水平表達情況。

2.5 主要檢測技術與方法

DNA含量分析：依照CyQUANT細胞增殖檢測試劑盒操作步驟(購自Invitrogen公司)進行實驗，其中激發波長為450 nm，發射波長為530 nm。

CCK-8法：依照CCK-8試劑盒操作步驟(購自Abcam公司)進行實驗，使用酶聯免疫檢測儀OD 450 nm處測量各孔的吸光值并計算。

實時熒光PCR法：收集細胞樣品，抽取總RNA，以2μg反轉20μL體系進行反轉錄。檢測Sclerostin、Col1A2、OC、OPN、Wnt5a、GSK-3β的mRNA表達。將反轉的cDNA稀釋5倍，進行實時PCR。擴增體系為10μL，反應條件：95℃預變性30 s；95℃5 s、60℃25 s，擴增50個循環。溶解曲線分析：95℃5 s；溶解曲線為單一峰說明是特異性擴增，陰性對照為ddH2O，GAPDH為內參，每個模板做3個復孔，結果使用相對定量2-△△Ct方法分析。引物序列詳見表1。

表1 實時聚合酶鏈反應引物序列

Western Blot法：收集細胞樣品，PBS清洗2次，按100∶1加入蛋白提取緩沖液RIPA(radioimmunoprepciption assay)和蛋白酶抑制劑PMSF(phenylmethanesulfonyl fluoride)提取蛋白，置于冰上30 min后，4°C 12000 rpm離心10 min，吸除上清，4℃備用，置于-20℃長期保存。BCA法檢測蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，用0.22μm孔徑的PVDF膜轉膜，5%BSA封閉1 h，4°C一抗孵育過夜后使用0.05%TBST充分洗滌；孵育二抗，常規ECL發光液顯色。

ALP染色、活性分析與茜素紅染色：在成骨誘導的第28天，使用固紫B試劑盒(購自Sigma公司)以及茜素紅染色法進行染色，并通過倒置顯微鏡觀察拍照記錄。使用磷酸酶分析試劑盒進行ALP定量檢測(購自上海碧云天)；使用ImageJ軟件對茜素紅染色進行灰度檢測半定量分析。

2.6 統計學處理

采用PASSStatistics 22.0統計學軟件分析。數值采用(±s)表示，兩獨立樣本采用t檢驗，符合正態分布且方差齊性采用方差分析，方差不齊采用秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 活血接骨方含藥血清對BMSCs體外成骨分化及Sclerostin基因的影響

CCK-8檢測結果顯示：成骨誘導28天后與對照組相比(0.974±0.069)，中藥組(1.239±0.108，t=2.922，P=0.043)和BMP-4組(1.386±0.043，t=7.132，P=0.002)細胞活性增強，且中藥+BMP-4組(1.633±0.097，t=7.796，P=0.001)細胞活性明顯增強。DNA含量檢測結果也顯示：相較于對照組(0.973±0.066)，中藥組(1.191±0.086，t=2.821，P=0.048)、BMP-4組(1.407±0.074，t=6.156，P=0.004)和中藥+BMP-4組(1.627±0.063，t=10.135，P=0.001)高于對照組(1.004±0.066)，提示含有活血接骨方的大鼠含藥血清可以增強BMSCs細胞活性，且與BMP-4兩者聯用效果更強(圖1)。

圖1 各組BSMCs細胞活性比較。

ALP及定量檢查結果顯示：與對照組相比(0.913±0.055)，中藥組(1.221±0.105，t=2.848，P=0.022)、BMP-4組(3.193±0.209，t=14.591，P=0.001)和中藥+BMP-4組(4.961±0.426，t=13.105，P=0.001)BMSCs出現礦化現象、ALP活性增強。茜素紅染色及半定量檢測結果也顯示：相較于對照組(1.007±0.102)，中藥組(1.727±0.340，t=2.870，P=0.045)、BMP-4組(4.826±0.208，t=23.280，P=0.001)和中藥+BMP-4組(8.627±0.620，t=17.161，P=0.001)，提示含有活血接骨方的大鼠含藥血清可以增強BMSCs細胞活性，且與BMP-4兩者聯用效果更強(圖2)。

圖2 各組BSMCs細胞礦化程度的比較。

實時熒光PCR和Western Blot結果顯示：①與對照組相比，中藥組、BMP-4組和中藥+BMP-4組BMSCs成骨相關分子(Col1A2、OC、OPN)的mRNA和蛋白水平表達明顯上調(P＜0.05)；②與對照組相比，中藥組Sclerostin的mRNA和蛋白水平無明顯統計學差異(P＞0.05)，但BMP-4組和中藥+BMP-4組Sclerostin基因的表達明顯上調，且中藥+BMP-4組中Sclerostin基因的表達弱于BMP-4組(P＜0.05)，提示活血接骨方含藥血清可能通過抑制BMP-4介導的Sclerostin基因表達上調，促進BMSCs成骨分化過程(圖3-圖4)。

圖3 各組BSMCs中成骨相關基因與Sclerostin基因mRNA水平表達比較

圖4 各組BSMCs中成骨相關基因與Sclerostin基因蛋白表達比較

3.2 活血接骨方含藥血清對BMSCs成骨分化中Wnt信號通路的影響

使用(低濃度、中濃度、高濃度)不同濃度活血接骨方含藥血清干預BMSCs細胞7天并檢測相關指標后發現：①各組細胞CCK-8結果(F=3.251，P=0.081)及DNA含量(F=1.499，P=0.287)無統計學差異；②相對于空白對照組，Wnt5a的mRNA和蛋白水平表達呈現濃度依賴性上調(F=3.251，P=0.081)，而Sclerostin和GSK-3β的mRNA和蛋白水平呈現與之相反下降趨勢(P＜0.05)，且Tyr216位磷酸化激活的GSK-3β蛋白含量逐漸降低，表明GSK-3β的蛋白活性也逐漸降低，提示隨著含藥血清濃度增加，Wnt信號通路激活呈現濃度依賴性增強。(圖5-圖6、表2)

表2 各組BMSCs中Wnt信號通路相關分子及Sclerostin基因的mRNA表達(n=3,±s)

表2 各組BMSCs中Wnt信號通路相關分子及Sclerostin基因的mRNA表達(n=3,±s)

注：與對照組相比，a P＜0.05；與中藥組相比，b P＜0.05；與BMP-4組相比，c P＜0.05。

基因Wnt5a GSK-3β Sclerostin對照組1.013±0.139 1.037±0.056 1.066±0.049低濃度組1.733±0.089a 0.835±0.084a 0.902±0.065a中濃度組2.159±0.106ab 0.691±0.058ab 0.766±0.076ab高濃度組3.101±0.334abc 0.532±0.051abc 0.593±0.044abc

圖5 各組BSMC細胞活性比較。

圖6 不同濃度活血接骨方含藥血清對BMSCs中Wnt信號通路相關分子及Sclerostin基因的作用

4 討論

目前骨折的治療方法主要包括手術、藥物、電磁波、射頻等多種治療方法，但各種療效均具有自身局限性。中醫藥治療骨折由來已久，祖國醫學將骨折其歸屬到“骨折病”范疇，中醫藥治療骨折病要求辨證論治、和方圓之融，強調陰陽調和，具有多靶點、多因素、多方協同治療骨折的天然優勢。目前針對中醫藥治療骨折多集中于加強骨代謝形成、促進BMSCs成骨分化及原始骨組織形成等方面。BMSCs作為骨髓組織中具有多向分化能力的干細胞亞群，當機體發生骨折時，細胞會趨向性遷移、聚集于骨折斷端處并促成骨分化形成骨細胞，從而形成骨痂、促進骨折愈合。目前大量文獻表明，活血續骨類中藥可通過促進BMP-2、BMP-4、BMP-6等成骨因子表達或增加其促成骨作用，從而實現促進骨折愈合的作用。

“劉氏骨傷”作為無錫市非物質文化遺產[6]，多年來經多代傳人總結、完善形成的我科經驗方-活血接骨方(又名劉氏正骨方)，臨床使用療效確切。該方主要由地鱉蟲、血竭、川芎、川斷、乳香、沒藥、白術、丁香、杜仲、骨碎補、黨參、當歸、黃芪、自然銅、熟地、蘇木等藥物組成，方中杜仲、骨碎補、自然銅、川斷入腎經，補腎壯骨，續骨止痛；土鱉蟲性善走竄，能活血消腫續筋，熟地補血養陰，填精益髓；黨參、當歸、黃芪補益氣血；血竭、川芎、乳香、沒藥均為均有活血散瘀消腫功效，諸藥合用共奏“活血祛瘀，接骨續筋”之功效。大量臨床研究表明[7-9]，活血接骨方具有良好的臨床療效，但針對其促進骨折愈合的具體作用機制尚缺乏系統化、深層次的理論研究?；谏鲜鲋嗅t理論及現代研究結果，課題組為探究活血接骨方BMSCs成骨分化的影響，開展相關研究，結果發現活血接骨方含藥血清可以有效提高BMSCs細胞活性，且與BMP-4聯合使用時效果更佳。ALP活性作為成骨前細胞及成骨細胞分化的早期特異性指標，與細胞增殖程度呈正相關，是細胞發生礦化及促成骨分化的基礎。本研究結果中ALP染色和茜素紅染色結果也證實，活血接骨方含藥血清可以增強ALP活性及細胞礦化現象的發生。

骨代謝由多因素、多系統的復雜生物信息網絡進行調控，其中多種因子存在相互協作又相互制約的辯證關系[14]。為探究活血接骨方與對BMSCs成骨分化的影響。課題組通過文獻研究發現，Sclerostin基因作為BMP抑制物，對骨的形成代謝起負調控作用。骨源性細胞表達的Sclerostin可以通過抑制BMP因子活性降低骨源性細胞或成骨細胞的增殖，阻礙成骨分化過程，在體內受甲狀旁腺、雌激素等生物因子間接或持續性的抑制影響[15,16]。我們既往研究發現[17]，在人成骨細胞中BMP-4可以呈濃度依賴性促進Sclerostin基因表達。課題組前期研究發現[13]，在BMP-4體外干預下，通過siRNA沉默Sclerostin基因可以有效促進BMSCs成骨分化及細胞礦化現象。本研究結果也再次證實BMP-4可以上調BMSCs中Sclerostin基因表達，但有趣的是，僅用含活血接骨方的大鼠血清進行28天的體外干預后，細胞中Sclerostin基因表達無明顯統計學差異，但與BMP-4聯合使用后可以部分抑制BMP-4介導的Sclerostin基因上調作用而增強BMP-4促成骨作用，提示含活血接骨方可能通過下調Sclerostin基因表達增強BMP-4的促成骨作用。

為了進一步探究活血接骨方的調節BMSCs成骨分化的機制途徑，我們通過文獻研究發現[18]，Sclerostin主要通過抑制Wnt/β-catenin信號通路抑制成骨細胞活性。Wnt信號通路是與生長、發育以及腫瘤發生等生命過程息息相關，主要包括經典Wnt/β-catenin信號通路、非經典Wnt/Ca2+信號通路以及PCP途徑，其中經典Wnt/β-catenin信號通路對骨代謝的調節具有至關重要的作用[19]。當Wnt/β-catenin處于未激活狀態時，細胞質中β-catenin大部分被降解復合體磷酸化降解，從而維持一個較低的水平；而出現激活刺激信號時，BMSCs中Wnt蛋白(Wnt5a)與輔助受體低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(LRP5/6)和細胞跨膜特異性受體卷曲蛋白(Frz)相結合，通過磷酸化激活并作用于細胞質內Dsh蛋白，磷酸化的Dsh蛋白抑制糖原合成激酶(GSK-3β)活性，抑制β-catenin降解復合體活性，上調細胞質中β-catenin含量，β-catenin蛋白入核后啟動下游多種成骨相關轉錄因子和靶基因表達，促進BMSCs成骨分化、調節骨代謝平衡[20-21]。Sclerostin作為Wnt/β-catenin信號通路的一種可溶性抑制因子，可以通過競爭性與Wnt/β-catenin信號通路中Lrp5/6中的El螺旋區域結合，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路激活、阻礙骨形成。Wnt5a作為Wnt信號通路的關鍵因子既參與經典Wnt信號通路，又參與非經典Wnt信號通路；不僅促進BMSCs中成骨分化，也參與成骨細胞功能的調節[22]。在此基礎上，國外有學者[23]通過研究Wnt/βcatenin信號通路及BMP信號通路兩者與Sclerostin之間作用后發現，Wnt5a和GIN(GSK-3β抑制劑)均增加BMP-4誘導的BMP信號，BMP-4也可以增加Wnt5a和GIN誘導的Wnt信號。然而，GIN的效果要強烈得多；隨著Wnt信號通路的增加，Sclerostin表達量呈劑量依賴性下降，而在此過程中BMP-4可以誘導Sclerostin表達[24]。因此，課題組通過使用不同濃度中藥血清對BMSCs進行體外干預并檢測Sclerostin基因與Wnt信號通路相關因子表達情況發現，隨著含藥血清濃度的逐漸增高，Wnt5a表達呈現濃度依賴性逐漸增高趨勢，而Sclerostin基因和GSK-3β的mRNA和蛋白表達水平則呈現逐漸下降趨勢。GSK-3β是Wnt/β-catenin經典信號通路的關鍵因子，是一種在高度保守的絲氨酸／蘇氨酸激酶，可以通過不同位點磷酸化發揮不同作用，當Ser9位點磷酸化可抑制GSK-3β蛋白活性，上調細胞質內β-catenin細胞內含量，促進下游成骨基因表達；相反，當Tyr216位點磷酸化可激活GSK-3β蛋白活性，降低細胞質內β-catenin細胞內含量，抑制下游成骨基因表達。本次研究結果中，隨著中藥血清濃度增高，BMSCs中總GSK-3β蛋白含量逐漸降低，且Tyr216位點處的磷酸化GSK-3β蛋白也呈現降低趨勢，提示活血接骨方含藥血清體外誘導BMSCs成骨分化過程中，可能通過抑制Sclerosti基因表達，上調Wnt5a基因表達、下調GSK-3β基因表達及Tyr216位點的磷酸化從而促進Wnt/β-catenin經典信號通路激活，誘導BMSCs成骨分化過程。但在長期體外干預狀態下，活血接骨方含藥血清是否一直對WnWnt/β-catenin信號通路存在持續性影響還有待進一步探討。

綜上所述，活血接骨方含藥血清可以體外促進BMSCs成骨分化，這種促成骨作用可能與BMSCs中抑制因子Sclerostin表達，激活Wnt信號通路從而促進成骨相關基因表達有關。采用現代分子生物細胞學技術，初步探討活血接骨方治療骨折可能的作用機制，為中醫藥治療骨折提供新的思路與理論依據。

本研究局限：①本研究選用動物中藥灌服法制備含藥血清進行干預，受給藥時機、給藥方案、采血方法等因素影響，中藥復方入血成分是否為藥效的主要成分仍需進一步深入挖掘；②僅初步探究Wnt信號通路，針對多信號通路之間交互作用，仍需進一步研究。