基于血管生成探討補腎養精顆粒對早發性卵巢功能不全大鼠模型的影響＊

張 芳，劉 震，于 瀟，丁 怡，張毅然，石雅馨，劉金星＊＊

(1.山東中醫藥大學第一臨床醫學院 濟南 250014；2.山東中醫藥大學附屬醫院 濟南 250014)

早發性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)是指女性40歲之前出現4個月以上的閉經或月經稀發，且連續2次的血清FSH水平＞25IU/L(間隔4-6周)[1]。其臨床以月經異常為主，可伴有潮熱、盜汗、性交不適，陰道干澀，睡眠不佳等雌激素缺乏的癥狀[2]，甚至引起不孕，發病率為1%[3]，且逐年上升，是婦科常見的疑難病種，嚴重影響女性的身心健康和生活質量。近年來，隨著社會的快速發展，工作節奏的加快，加之環境因素等綜合影響，POI的發病率逐年升高，且有向低齡化發展的趨勢[4]。目前針對POI缺乏有效的治療手段，常規激素補充治療可緩解患者雌激素缺乏的癥狀，但無法重建患者卵巢功能。在新版2017早發性卵巢功能不全的臨床診療中國專家共識，指出“中藥可做為一種治療POI的非激素藥物”[5]。

目前引發POI的機制尚不明確，現代醫學主要從遺傳因素、醫源性因素、免疫因素、環境因素等進行研究。POI是一個過程，絕非一個事件。各種病因引起的POI，均以卵巢中的卵泡發育不良或閉鎖太快為特征。初級卵泡(致密無血管)逐漸發育為次級卵泡(有血管)的過程中，卵泡液的形成及卵泡的成熟均離不開血管的供養，卵巢血管生成對卵泡發育起著至關重要的作用[6]。現代研究發現，卵巢血流灌注指標對卵巢儲備功能具有一定預測作用，POI患者的卵巢血流灌注參數高于健康婦女，且血清VEGF含量較低。

補腎養精顆粒具有補腎填精之效，可改善患者卵巢功能，提高妊娠率[7]。歷代婦科醫家均倡導“女子以血為本”，就“血”的物質屬性——滋養、循行功能而言，上述之“血”與血液之“血”具有一定的相似性。基于二者相似的功能及精血同源理論，在上山東省重點研發計劃(2019GSF108208)的支撐下，預從血管生成及凋亡相關因子角度進一步闡述補腎養精顆粒改善POI模型大鼠卵巢功能的機制。

隨機分組空白組模型組BSYJKL-Low BSYJKL-Medium BSYJKL-High補佳樂組動情周期篩選1-7天造模生理鹽水灌胃50 mg·kg-1雷公藤多苷灌胃50 mg·kg-1雷公藤多苷灌胃50 mg·kg-1雷公藤多苷灌胃50 mg·kg-1雷公藤多苷灌胃50 mg·kg-1雷公藤多苷灌胃8-21天藥物干預生理鹽水灌胃生理鹽水灌胃1.75 g·kg-1補腎養精顆粒低劑量灌胃3.50 g·kg-1補腎養精顆粒中劑量灌胃7.00 g·kg-1補腎養精顆粒高劑量灌胃0.1 mg·kg-1補佳樂灌胃22-36天

1 材料

1.1 實驗藥物

①雷公藤多苷片：10 mg/片(遠大醫藥黃石飛云制藥有限公司，20190110)；②戊酸雌二醇片(補佳樂)，1 mg/粒，拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司分包裝生產，生產批號：352A；③補腎養精湯：熟地12 g、當歸12 g、白芍12 g、川芎9 g、菟絲子18 g、枸杞子15 g、鹽車前子6 g、制五味子9 g、覆盆子9 g、川牛膝15 g、醋香附12 g、炒枳殼12 g、黨參12 g、炙淫羊藿12 g、鹽知母12 g、益母草15 g，廣州一方藥業中藥免煎顆粒。

1.2 動物

7-8周齡SPF級SD雌性大鼠(購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，生產許可證號:SYXK(魯)2014 0007)，體質量(180-200)g。動物飼養環境：山東中醫藥大學附屬醫院動物房飼養，將室溫控制在20℃-24℃，相對濕度維持在45%-55%。造模時間均選擇大鼠動情前期。

1.3 試劑

ELISA試劑盒：E2(RA20666)、AMH(RA20211)、NF-κB(RA20170)、MMP-2(RA20502)、Caspase-3(RA20292)、Caspase-9(RA20290)均由武漢貝茵萊生物科技有限公司提供；全蛋白提取試劑盒(BC3710-100T，)由solarbio，提供；MMP-2(bs-4599R)、Caspase-3(Bsm-33284M)、Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)HRP(bs-40295G-HRP)，均由Bioss提供。

1.4 儀器

全波長酶標儀，賽默飛世爾科技有限公司；電泳儀，美國伯樂公司；化學發光成像儀，日本富士公司；顯微鏡，徠卡生物系統有限公司。

2 方法

2.1 動物分組

常規飼養1周適應環境后，挑選動情周期正常大鼠，隨機分為正常組、POI模型對照組、補腎養精顆粒高劑量組(BSYJKL-High)，補腎養精顆粒中劑量組(BSYJKL-Medium)，補腎養精顆低劑量組(BSYJKLLow)，補佳樂組，各10只，分別編號、稱重。

2.2 動物干預

模型制備：按照參考文獻[8]，空白組大鼠予生理鹽水灌胃；其他各組大鼠給予雷公藤多苷混懸液50 mg·(kg·天)-1灌胃，連續14天。

藥物干預：中藥192 g，相當于配方顆粒33.3 g。參照人與動物之間藥物劑量換算方法，分別灌服補腎養精顆粒1.75 g·(kg·天)-1、3.50 g·(kg·天)-1、7.0 g·(kg·天)-1，補佳樂0.1 mg·(kg·天)-1，連續15天。余兩組予生理鹽水灌胃。

2.3 取材時點

補腎養精顆粒干預的第1、3、5、7、9、11、13天陰道涂片觀察動情周期的變化；藥物干預結束48 h內處死大鼠。

2.4 檢測指標

用10%水合氯醛注射大鼠腹腔，麻醉后固定大鼠，將大鼠腹中部皮膚去毛，常規消毒，鋪巾，切口進腹，暴露卵巢，肉眼大體觀察大鼠卵巢情況后，剪取大鼠卵巢，并采集腹腔靜脈血。

表2 補腎養精顆粒對大鼠動情周期的影響(±s,n=10)

表2 補腎養精顆粒對大鼠動情周期的影響(±s,n=10)

注：與空白組相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

分組空白組模型組BSYJKL-Low BSYJKL-Medium BSYJKL-High補佳樂組動情周期/天3.8±1.08 8.4±0.84＊＊7.00±0.67＊＊△△5.70±0.94＊＊△△6.6±1.07＊＊△△4.8±0.79＊△△

表4 補腎養精顆粒對POI模型大鼠血清NF-κB、MMP-2的影響(±s,n=4)

表4 補腎養精顆粒對POI模型大鼠血清NF-κB、MMP-2的影響(±s,n=4)

注：與空白組相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01.

分組空白組模型組BSYJKL-Low BSYJKL-Medium BSYJKL-High補佳樂組NF-κB/(umol·L-1)1.18±0.01 0.07±0.04＊＊0.60±0.06＊＊△△1.28±0.10△△1.22±0.06△△1.14±0.02△△MMP-2/(ng·mL-1)1.22±0.12 0.76±0.24＊＊0.92±0.12＊1.05±0.15△0.83±0.11＊＊0.99±0.17

2.4.1 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)

采用ELISA檢測各組大鼠血清E2、AMH及NFκB、MMP2、Caspase-3、Caspase-9水平。取腹腔靜脈血，室溫放置1 h后，離心機中1000 rpm離心15 min用移液器取出血清，用武漢貝茵萊生物科技有限公司的試劑盒進行ELISA分析，在450 nm處讀取光密度，通過標準曲線計算上述指標濃度。

2.4.2 Western Blot分析

根據全蛋白提取試劑盒說明書研磨卵巢組織，離心獲得上清液，加入1×loading buffer進行蛋白變性處理。將蛋白樣品置入10%的SDS-PAGE膠加樣孔內，采用濕轉，轉膜電流為260 mA，轉膜時間為30-60 min，然后在室溫下用5%脫脂奶粉將其封閉1 h。分別使用MMP-2、MMP-9、VEGF、Caspase-3抗體孵育過夜，繼室溫孵育二抗1 h后采用極超敏的化學發光底物進行顯影，利用image J圖像分析軟件對圖像的光密度進行了分析。

2.5 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件，計量資料采用均數±標準差(±s)形式表示，采用t檢驗，多組間比較，符合正態分布的采用方差分析，不符合正態分布的采用秩和檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

表3 補腎養精顆粒對血清E2、AMH的影響(±s,n=4)

表3 補腎養精顆粒對血清E2、AMH的影響(±s,n=4)

注：與空白組相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

分組空白組模型組BSYJKL-Low BSYJKL-Medium BSYJKL-High補佳樂組E2/(pg·mL-1)77.72±12.49 59.70±16.70＊67.32±12.72 76.73±2.80△77.84±11.82△66.62±5.14 AMH/(ng·mL-1)4.21±0.24 3.20±0.60＊3.75±0.59 4.11±0.57△4.12±0.80△3.94±0.22

表5 補腎養精顆粒對POI模型大鼠血清Caspase-3、Caspase-9的影響(±s,n=4)

表5 補腎養精顆粒對POI模型大鼠血清Caspase-3、Caspase-9的影響(±s,n=4)

注：與空白組相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

分組空白組模型組BSYJKL-Low BSYJKL-Medium BSYJKL-High補佳樂組Caspase-3/(ng·mL-1)8.88±0.95 13.02±0.24＊＊13.42±1.70＊＊10.82±1.24＊△△12.11±0.62＊＊10.73±0.83＊△△Caspase-9/(ng·mL-1)13.14±1.53 16.66±1.45＊＊16.39±1.47＊＊15.20±1.92 13.45±1.70△△14.07±0.66△

3 結果

3.1 補腎養精顆粒對大鼠動情周期的影響

根據參考文獻[9]，判定大鼠動情周期。與空白組相比，模型組動情周期明顯延長(P＜0.05)；與模型組相比，補腎養精顆粒低劑量、中劑量、高劑量，補佳樂明顯縮短(P＜0.05)。提示補腎養精顆粒可縮短POI模型大鼠的動情周期。

3.2 補腎養精顆粒對血清E2、AMH的影響

在E2、AMH方面，與空白組相比，模型組明顯降低(P＜0.05)；與模型組相比，補腎養精顆粒中劑量組、高劑量組明顯升高(P＜0.05)，且與空白組無明顯統計學差別(P＞0.05)。提示補腎養精顆粒中、高劑量可提高POI模型大鼠E2、AMH水平。

3.3 補腎養精顆粒對POI模型大鼠血清NF-κB、MMP-2的影響

在NF-κB、MMP-2方面，模型組均較空白組明顯降低(P＜0.01)；與模型組相比，補腎養精顆粒中、低、高劑量、補佳樂組的血清NF-κB濃度明顯升高(P＜0.01)，以補腎養精顆粒中劑量組最佳，且與空白組無明顯統計學差異(P＞0.05)。與模型組相比，補腎養精顆粒中劑量組的血清MMP-2明顯升高(P＜0.05)，且與空白組無明顯統計學差異(P＞0.05)。提示補腎養精顆粒可提高POI模型大鼠NF-κB、MMP-2水平。

圖1 蛋白條帶

3.4 補腎養精顆粒對POI大鼠血清Caspase-3、Caspase-9的影響。

在Caspase-3、Caspase-9方面，POI模型組明顯較空白組升高(P＜0.05)，與模型組相比，補腎養精顆粒中劑量組、補佳樂組的血清Caspase-3濃度明顯降低(P＜0.05)，但仍高于空白組(P＜0.05)；補腎養精顆粒高劑量組，補佳樂組血清Caspase-9明顯低于模型組，且與空白組無明顯統計學差異(P＞0.05)。提示補腎養精顆粒可降低POI模型大鼠Caspase-3、Caspase-9水平。

3.5 補 腎 養 精 顆 粒 對MMP-2、MMP-9、VEGF、Caspase-3蛋白的影響

由圖2可見，模型組的MMP-2、MMP-9、VEGF的蛋白含量均低于空白組，而Caspase-3明顯升高(P＜0.01)；由圖2-A可見，補腎養精顆粒低劑量組、中劑量組的MMP-9蛋白含量明顯高于模型組(P＜0.05)；由圖2-B、C可見，補腎養精顆粒低劑量組、中劑量組、高劑量組的MMP-2、VEGF含量明顯高于模型組(P＜0.05)；由圖2-D可見，各治療組的Caspase-3含量明顯低于模型組(P＜0.01)。提示補腎養精顆粒可提高POI模型大鼠卵巢組織中MMP-2、MMP-9、VEGF的蛋白表達，并降低Caspase-3的表達。

圖2 目的蛋白平均光密度

3.6 HE染色

由圖3可見，空白組卵泡體積較大，各級卵泡及顆粒細胞發育良好，間質未見明顯的炎性細胞浸潤及纖維化發生，血管豐富。模型組大鼠泡體積較小，各級卵泡數目減少，閉鎖卵泡增多，間質內可見少量炎性細胞浸潤，血管減少；補腎養精顆粒低劑量組及中劑量組，卵泡發育及血管分布情況優于模型組，但與空白組有差別；補腎養精顆粒高劑量組及補佳樂組卵泡體積較大，各級卵泡及顆粒細胞發育良好，血管豐富，與空白組無明顯差別。提示補腎養精顆粒可促進POI模型大鼠的卵泡發育，增加卵泡數目。

圖3 HE染色圖片

表6 補腎養精顆粒對卵泡的影響(±s,n=5)

表6 補腎養精顆粒對卵泡的影響(±s,n=5)

注：與空白組相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

分組空白組模型組BSYJKL-Low BSYJKL-Medium BSYJKL-High補佳樂組始基卵泡10.80±0.84 7.20±0.84＊＊8.20±0.84＊＊8.60±0.89＊＊△9.60±1.14△△9.80±1.30△△竇前卵泡8.40±0.89 6.40±0.55＊＊6.80±0.84＊＊7.20±0.84＊7.80±0.84△8.20±0.84△△竇狀卵泡4.8±0.84 3.2±0.45＊＊3.6±0.55＊＊3.8±0.84＊4.2±0.45△4.4±0.55△△閉鎖卵泡4.6±0.89 8.8±0.84＊＊6.8±0.84＊＊△△6.2±0.84＊＊△△5.4±0.55△△5.2±0.45△△

4 討論

POI屬于中醫學“月經后期”“閉經”“經斷前后諸證”“不孕”等范疇。多數中醫學者認為本病以腎虛為主，腎虛是早發性卵巢功能不全的主要病機，補腎為其治療大法[10]。中醫藥辨證治療能有效消除臨床癥狀、改善卵巢儲備功能及促進卵母細胞成熟和排出，臨床療效認可度較高，正成為POI極具潛力的治療方案，傳統的湯藥、現代的中成藥，治療POI均有明確的效果[11,12]。

山東名中醫藥專家，本研究團隊負責人劉金星教授，在治療POI(既往所稱“卵巢早衰”)30多年的臨床實踐基礎上，基于“腎主生殖”理論創制“補腎養精顆粒”，由四物湯、五子衍宗丸及二仙湯加減而成。方中四物湯養血，五子衍宗丸補腎益精，使精血互生；淫羊藿補腎溫陽，取其陽中求陰之功，以增強補腎填精之效；炒知母瀉火堅陰，與淫羊藿相配，以制約淫羊藿溫熱之性，取淫羊藿陽中求陰之功而不助虛熱。全方共奏補腎填精之效。

目前血清E2、AMH以及動情周期的改變是評定大鼠卵巢儲備功能的重要指標，予雷公藤多苷片誘導后POI模型大鼠卵泡募集和選擇過程異常，表現為E2、AMH水平下降，動情周期延長。本研究發現，與空白組相比，POI模型大鼠的血清E2、AMH表達下降，予補腎養精顆粒干預后二者血清水平升高，動情周期恢復，卵巢儲備功能改善。提示補腎養精顆粒可改善卵泡募集和選擇。

婦女正常的月經來潮、胎兒的孕育及分娩、乳汁的分泌均以血為用，卵巢的功能亦受到血管的結構及血流的影響[13]。婦女生理以“數脫血、耗血”為特點，又常處于不足于血的生理狀態，POI患者更表現為“精血虧虛”的病理狀態。POI患者不足于血，失于濡養，其理化指標表現為卵巢的血流灌注參數偏高，而卵巢血管化指數、血流指數、血管化血流指數偏低[14]。予雷公藤多苷誘導后，POI模型大鼠卵巢間血管分布較少，卵泡發育不良，成熟卵泡減少，與張永方的研究相符[15]。予補腎填精之效的補腎養精顆粒干預后，血管分布增加，卵泡發育改善，且成熟卵泡增多。

中醫之“血”與西醫之“血”存在交匯點：具有滋潤、濡養作用，并周流全身。VEGF可能為二者潛在的交匯點，可促進微毛細血管(卵泡周圍)的生成，為血液中的FSH和LH作用于更多的卵泡提供便利條件，與卵泡的發育與成熟息息相關。且VEGF的周期性變化與女性月經周期中氣血變化具有一定的相似性：在經后期至排卵期，血氣漸復，而VEGF在卵泡顆粒細胞及膜細胞中的表達逐漸增強。現代藥理研究發現雷公藤具有抑制細胞增殖和血管生成的作用[16]，該研究，予大鼠雷公藤多苷誘導后，模型組大鼠卵巢內VEGF呈現低表達，與徐文君研究相符[17]。予補腎養精顆粒干預后可提高卵巢組織內VEGF的蛋白表達量。提示補腎養精顆粒可通過補益精血提高VEGF的表達，參與血管新生，改善卵巢功能。

細胞外基質(Extracellular matrix，ECM)周期性的重建是維持卵巢的正常功能的必要條件，參與了卵泡的發育及閉鎖過程。MMP-2、MMP-9是ECM降解過程中最主要的蛋白水解酶，存在于卵泡的特定細胞和組織上[16]。MMP-2、MMP-9可由發育中的卵泡分泌，且參與了血管的生成，予大鼠雷公藤多苷誘導后，大鼠的MMP-2、MMP-9表達降低，可能與大鼠各級卵泡及血管分布減少有關，予補腎養精顆粒干預后，大鼠卵泡數目及血管分布增多，且卵巢組織中MMP-2、MMP-9的蛋白表達增高，可能與補腎養精顆粒能促進卵泡發育及血管生成有關。

NF-κB存在范圍廣泛，亦表達于卵巢組織中，主要是通過調控多種促血管生成因子如VEGF、MMP-2、MMP-9的轉錄與促進血管平滑肌細胞的增殖來參與血管的形成。模型組大鼠血清NF-κB的濃度明顯低于空白組，提示POI模型組大鼠血管生成受限；予補腎養精顆粒干預后可明顯提高其血清含量，提示補腎養精顆粒可能通過調控NF-κB的表達，參與血管生成。

卵泡的正常發育不受單個卵泡閉鎖的影響，但大量卵泡閉鎖(高于生理代謝速度)則會引起POI的發生。Caspase家族成員是最終啟動細胞凋亡的執行者，Caspase-3、Caspase-9是細胞凋亡的必經途徑，與卵泡閉鎖密切相關。本研究發現予雷公藤多苷片誘導后，POI模型大鼠的閉鎖卵泡數目增多，且卵巢組織中Caspase-3、Caspase-9表達升高，而予補腎養精顆粒干預后閉鎖卵泡數目減少，且Caspase-3、Caspase-9表達降低，提示補腎養精顆粒可抑制POI模型大鼠卵泡閉鎖與凋亡。

綜上所述，“女子以血為本”中的“血”是抽象的、不可定量、定性觀察，但與西醫學之“血”具有相似之性。雷公藤可抑制血管生成，卵泡失于血的濡養作用，則發育受阻，甚至閉鎖；補腎養精顆粒具有補腎填精之效，精血同源，故補腎養精顆粒可通過升高血管生成相關因子NF-κB、MMP-2、MMP-9、VEGF的表達，降低凋亡相關因子Caspase-3、Caspase-9的表達，進而改善血清E2、AMH水平，促進卵巢血管的形成及卵泡的發育。