擇時針刺對炎性疼痛模型P2X7-/-小鼠穴區成纖維細胞p38MAPK表達的影響＊

劉 祎，景明夷，白艾靈，韋 婷，蔡定均

(成都中醫藥大學針灸推拿學院 成都 610036)

擇時針刺是廣受關注的一種針刺療法，其效應與穴位局部結構及功能狀態變化密切相關[1]。穴位區域成纖維細胞可感知針刺等機械刺激并將其轉換為機體可識別的生物信號，繼而引發多種生物學效應[2-4]。不同時間針刺穴區成纖維細胞出現的變化不一。我們前期研究發現，在ZT0(7：00)、ZT4(11：00)、ZT8(15：00)、ZT12(19：00)、ZT16(23：00)、ZT20(3：00)時間點針刺足三里穴，穴區成纖維細胞橫截面積增大，呈圓梭形排列，骨架重構不同，其中以ZT8最明顯[5]。ZT8時間點針刺穴區成纖維細胞發生改變的同時，其細胞膜上P2X7受體也發生明顯變化[6]。MAPK相關信號通路被證明在細胞骨架中的微管、微絲和中間纖維等結構的調節中發揮重要作用[7-10]，p38MAPK及其磷酸化改變是其中的關鍵環節之一。在經典炎性疼痛模型下，我們已證明ZT8時間點針刺可調節野生型小鼠穴區p38MAPK表達量[6]，故本實驗選用P2X7-/-小鼠建立炎性疼痛模型，觀察ZT8針刺足三里對穴區p38MAPK表達的影響，以明確P2X7受體是否通過p38MAPK信號通路介導擇時針刺對成纖維細胞骨架的重構。

1 材料

1.1 動物

P2X7-/-小鼠18只，雌雄皆可，體質量20±2 g，10-14周齡，自JAX實驗室引進，購買于北京維通利華實驗動物技術服務公司。實驗在成都醫學院SPF級實驗室進行，每Optimice 100 EVC籠具內飼養5-7只動物。自動光－暗控制[L:D為12:12，即07:00-19:00光照(light，L)，19:00-07:00暗置(dark，D)]，籠具內隔音、通風、恒溫(22-24℃)，相對濕度50%-60%。所有動物均飼以SPF級顆粒飼料與滅菌水，并由成都醫學院實驗動物中心提供。

1.2 試劑

ECL發光試劑盒(批號：BL520A，美國Thermo公司)，預染蛋白Marker(批號：00215343，美國NEB公司)，PVDF膜(美國Hybond公司)。P38抗體、兔單克隆抗體(批號：ab32142)，β-actin抗體、鼠單克隆抗體(批號：ab8226)，生物素化山羊抗鼠IgG(H+L)(批號：ab6789)，生物素化山羊抗兔IgG(H+L)(批號：ab6721)，以上抗體皆購買于Abcam艾博抗(上海)貿易有限公司。

2 方法

2.1 動物篩選

所有動物經過7天光-暗周期同步馴化后，選用與光-暗周期同步的動物，采用輻射熱甩尾法在上午8點到12點間測定痛閾。具體方法：先安撫動物，待其情緒平穩后將其放入自制的圓桶型小鼠固定器中，頭部向前，使尾巴充分暴露并自然放松。待動物完全安靜后，將尾巴的中下三分之一處平放在疼痛甩尾測試儀(7360型，意大利Ugo Basile)的光熱輻射孔上，然后點擊測試鍵，記錄該孔中開始發出熱刺激直接照射到動物尾部皮膚到動物尾巴主動甩開的這段時間，即為甩尾反應潛伏期。同一只動物測定時間間隔在5 min以上，以防動物被燙傷或者被激怒。操作過程由固定人員在同一室內環境(室內溫度保持在22-24℃，相對濕度為50%至60%之間)下進行，最終痛閾值以3次測定值的平均數為準。

痛閾篩選標準：在3-10 s內動物能產生甩尾反應即納入實驗；甩尾時間低于3 s或高于10 s的動物剔除實驗，表明此類動物出現痛覺過敏或反應遲鈍。

2.2 實驗分組

動物篩選完成后，運用SPSS21.0統計軟件根據痛閾值完全隨機分組，分為空白組6只、造模組12只。造模組模型復制完成后，使用相同統計軟件據痛閾值將12只動物隨機分為模型組6只、模型+針刺組6只。

2.3 模型復制

分組完成以后，在造模組動物的右足足墊部皮內注射完全弗氏佐劑20μL?？瞻捉M動物于相同部位注射劑量相當的生理鹽水。處理結束24 h后，能夠看到造模動物注射的右足區域出現明顯的紅腫(圖1)，造模組動物通過疼痛甩尾儀檢測到的痛閾潛伏期相對造模前顯著縮短，說明造模組右足部進入急性炎癥疼痛階段，提示造模成功。

圖1 造模成功圖

2.4 時間點選擇

ZT表示授時因子(Zeitgeber)，本次實驗中ZT0為開燈時間(7：00)，ZT12即關燈時間(19：00)。依據前期相關實驗研究結果[5]，本次實驗選用ZT8(15:00)特定時間點進行動物處理。

2.5 動物處理

各組動物在相同時間點進行處理，處理方法如下：

2.5.1 模型+針刺組(下文簡寫作模針組)

操作前先以自制圓桶型固定器固定好動物，然后選用13 mm毫針針刺右側足三里穴，針刺深度約3 mm，每5 min采用捻轉法行針1次，每次行針1 min，頻率為120次/min，共留針30 min。每天1次，連續處理7天。足三里定位參照《實驗針灸學》[11]，位于膝關節后外側，在腓骨頭下約0.3 cm處的肌溝中。

2.5.2 模型組

在模針組動物接受針刺處理的同一時間內，模型組使用同一固定器及同樣的固定方式固定動物30 min，不進行其他處理。

2.5.3 空白組

在模針組動物接受針刺處理的同一時間內，空白組使用同一固定器及同樣的固定方式固定動物30 min，不進行其他操作處理。

2.6 取材

在第7天針刺結束后，采取頸椎脫臼法處死動物，立即取足三里穴區皮膚及皮下組織(面積約2 mm*2 mm，深度為2-3 mm)，用5 cm*5 cm的錫箔紙包裝好后立即置于-80℃液氮瓶中冰凍儲存。

2.7 指標檢測

P2X7-/-小鼠穴區成纖維細胞p38MAPK基因的表達：提取樣本總RNA后，進行除去反應(表1)和逆轉錄反應(表2)。本研究所用引物及堿基序列如下所示(表3)：

表1 DNA去除反應體系

表2 逆轉錄反應體系

表3 本次檢測所用引物及堿基序列

實時熒光定量PCR反應(表4、表5)結束后進行計算分析，使用Thermo Scientific PikoReal軟件(Thermo公司)分析PCR過程各檢測樣本的Ct(Threshold cycle)值。本實驗通過2-ΔΔCT計算X相對mRNA表達水平 ：ΔCTintervention= CTintervention 目 的 -CTintervention內參，ΔCTblank=CTblank目的-CT blank-內參，ΔΔCT=ΔCT intervention-ΔCT blank，XmRNA表達差別倍數以2-ΔΔCT表示。

表4 PCR反應體系

表5 PCR反應程序

P2X7-/-小鼠穴區成纖維細胞p38MAPK蛋白的表達：提取穴區皮膚組織樣本后，采用BCA法測定樣本蛋白濃度，將完成轉膜、封閉后的PVDF膜放入一抗中，(一抗濃度：P38 1:2000；β-actin 1:5000)，4℃孵育過夜，用TBST將PVDF膜洗3次，每次5 min；然后放入二抗(稀釋濃度：1∶5000)中，室溫孵育2-3 h；用TBST將PVDF膜洗3次，每次10 min。而后使用ECL發光試劑盒將A、B兩種發光液進行等體積混合，然后均勻的滴至膜上，反應1 min后去殘液，進行曝光。最后進行圖像解析，結果表示為目標蛋白的相對表達量。

2.8 統計方法

采用SPSS21.0統計軟件進行統計分析。數據以±s表示，多樣本均數間比較采用One-Way ANOVA檢驗，方差齊則采用LSD檢驗，方差不齊則采用Tamhane’s T2檢驗，檢驗結果以P＜0.05時認為其組間差異有顯著性。

3 結果

3.1 擇時針刺后P2X7-/-小鼠穴區成纖維細胞p38MAPK基因的表達

模型組小鼠穴位皮膚及皮下組織中p38MAPK基因與空白組相比，其表達升高，有統計學意義，P＜0.05；與模型組相比，模針組小鼠穴位皮膚及皮下組織中p38MAPK基因表達降低，有統計學意義，P＜0.05(表6、圖2)。

圖2 A：p38MAPK擴增曲線圖；B：p38MAPK溶解曲線圖

表6 P2X7-/-小鼠穴位皮膚及皮下組織中p38MAPK mRNA的表達變化(±s)

表6 P2X7-/-小鼠穴位皮膚及皮下組織中p38MAPK mRNA的表達變化(±s)

注：模型組對比空白組，#P＜0.05，模針組對比模型組，*P＜0.05。

組別空白組模型組模針組樣本數量(例)6 6 6 2-ΔΔCT(基因表達值)1.043±0.357 3.497±1.497#1.290±0.846*

3.2 擇時針刺后P2X7-/-小鼠穴區成纖維細胞p38MAPK蛋白的表達

模型組小鼠皮膚組織中P38蛋白較空白組，表達明顯升高，存在顯著統計學差異，P＜0.01；與模型組相比，模針組小鼠皮膚組織中P38蛋白表達量降低，有顯著統計學意義，P＜0.05(表7、圖3)。

表7 各實驗組小鼠皮膚組織中P38MAPK蛋白表達量(±s)

表7 各實驗組小鼠皮膚組織中P38MAPK蛋白表達量(±s)

注：模型組與空白組相比，**P＜0.01；模針組與模型組相比，△P＜0.05。

組別空白組模型組模針組送檢標本(例)6 6 6蛋白相對表達量1.0010±0.0510 1.4153±0.3144**1.1151±0.1823△

圖3 足三里穴區皮膚組織中p38MAPK蛋白表達量

4 討論

針刺效應具有時間特異性，不同時間點針刺所產生的臨床療效不同。在《黃帝內經》中就已經提出了針刺須“逢時候氣”，《靈樞·四時氣》篇指出“四時之氣，各有所在”，即季節有異，“灸刺之道，得氣穴為定”，故而針刺方法也應有所不同。在現代臨床研究中，也運用了許多擇時針刺的治療方法，并取得良好的療效。在治療經前期綜合征中，梁潔莎等[12]將子午流注開穴法與中藥結合，取得顯著療效；在治療IBS-D中，研究者[13]采用飛騰八法定時取穴，與常規取穴針刺組比較，發現其療效更優，并更大程度上改善了患者生活質量；在觀察腦卒中后晝間嗜睡的遠期療效中，研究人員[14]發現醒腦開竅法聯合靈龜八法針刺治療，結果與對照組相比更具優勢。同時，我們也觀察到針刺鎮痛具有一定的時相特征，沈曉煒[15]在ZT0(07：00)到ZT20(03：00)時間段內等分的6個時間點中，分別針刺炎性疼痛模型大鼠足三里穴，實驗發現針刺后大鼠痛閾值皆出現上升，但反應強弱存在時間差異，其反應曲線呈現單峰一谷結構，在ZT8(15：00)時間點所表現的經穴反應性最佳，而ZT16(23：00)時間點反應最差。

在前期研究中，我們通過激光共聚焦顯微鏡觀察發現，ZT8時間點針刺炎性疼痛模型下的野生型小鼠，其穴區成纖維細胞排列的形態更加規整[6]，細胞骨架重構明顯，橫截面積增大，均勻分布在細胞核四周，細胞間骨架交織成網狀，穴區維持細胞形態的骨架蛋白F-actin及微管蛋白β-tubulin的表達明顯高于空白組和模型組；而P2X7-/-小鼠各組成纖維細胞排列變化不大，細胞骨架重構不明顯，F-actin、β-tubulin的表達遠遠不及野生型小鼠，成纖維細胞分布的數量也更少，這可能與P2X7受體的缺失有關。因此，擇時針刺對穴區成纖維細胞骨架的重構可能與細胞膜上P2X7受體密切相關。

為了進一步觀察該受體是如何發揮作用的，我們聚焦于MAPK相關信號通路。MAPK是一組廣泛分布的絲/蘇氨酸蛋白激酶，p38MAPK被認為是細胞骨架穩定性的調節因子［16,17]。倪永梁[18]研究證實調亡蛋白Bax和cleaved-caspase 3誘導足細胞的凋亡與P38蛋白磷酸化的上調有關，并且P38蛋白磷酸化參與下調骨架調節蛋白synaptopodin表達來引起F-actin細胞骨架改變。P38MAPK還與口腔內成纖維細胞機械力的跨膜信號轉導及其內部壓力值變化有關[19]。細胞形態變化和骨架重構是局部組織響應外界作用力的重要環節，也是穴區響應針刺信號的關鍵結構，p38MAPK在其中扮演重要角色。我們前期研究亦發現，針刺對穴區p38MAPK表達量有明顯的調節作用[6]。因此，本實驗提出假設，P2X7受體可能是通過p38MAPK信號通路介導擇時針刺對成纖維細胞骨架的重構。實驗結果顯示，在P2X7-/-小鼠上建立炎性疼痛模型，選擇ZT8(15：00)針刺后測定穴區p38MAPK的mRNA和蛋白表達量，模型組小鼠p38MAPK蛋白表達量相對空白組升高，模針組小鼠皮膚組織中p38MAPK蛋白表達量相對于模型組降低。P38MAPK信號通路是介導細胞力信號傳導的重要途徑，可因一些炎性細胞因子及局部滲透壓改變等激活，故模型組p38MAPK表達明顯上升。已有研究表明[20]，針刺可通過抑制皮膚組織p38MAPK的表達來阻止膠原裂變及細胞外基質成分降解而起到抗皮膚衰老的作用，p38MAPK又是細胞骨架穩定性的調節因子，因此模針組p38MAPK表達的降低可能與針刺后穴區成纖維細胞骨架的重構密切相關。結合前期野生型小鼠針刺后p38MAPK的mRNA和蛋白表達量變化[6]來看，本次敲除P2X7受體基因后，擇時針刺信號對p38MAPK表達的影響仍然存在，與針刺野生型小鼠產生的變化一致。由此可知，在擇時針刺影響成纖維細胞骨架重構的效應中，P2X7受體并非通過對p38MAPK的調整以發揮作用，或者說不單純由此通路介導產生，可能還與局部骨架蛋白表達相關信號分子HSP27、P-Op18/stathmin等含量變化有關[21]。

本次研究選擇將基因敲除小鼠作為研究對象，觀察擇時針刺時，穴區成纖維細胞形態改變與P2X7受體對p38MAPK表達影響的關系，研究結果有助于闡釋擇時針刺的穴位局部啟動效應及機制。今后我們將繼續關注擇時針刺后穴區成纖維細胞形變的下游信號并開展深入，以期更好的揭示擇時針刺的穴位局部啟動機制。