SPR天然產物小分子抑制劑的“人工智能”藥物篩選和“網絡藥理”作用機制研究＊

艾中柱，王皓南，周珊珊，江經緯，袁勝濤，黃必勝，杜鴻志＊＊

(1.湖北中醫藥大學藥學院 武漢 430065；2.中藥資源與中藥化學湖北省重點實驗室 武漢 430065；3.湖北中醫藥大學中醫臨床學院 武漢 430065；4.中國藥科大學國家(南京)新藥篩選中心 南京 210009)

近年來，針對腫瘤細胞代謝特征的靶向治療，已成為腫瘤治療新策略和研究熱點，全球醫藥巨頭都聚焦于抗腫瘤代謝藥物研發[1]。正如，四氫生物蝶呤(Tetrahydrobiopterin：BH4)是腫瘤細胞代謝的關鍵物質，在腫瘤的發生發展中起到重要作用，通過調控腫瘤細胞BH4代謝可能是潛在治療策略[2]。其中，墨蝶呤還原酶(Sepiapterin reductase：SPR)是BH4合成的重要關鍵酶。1989年PNAS雜志首次報道稱，SPR抑制劑能夠抑制鼠源紅白血病細胞的增殖[3]；隨后，NIMH(美國國家心理健康研究所)的Kaufman課題組進一步確證了這一作用[4]。2015年，美國密西根大學的Bachmann課題組通過臨床數據分析表明，在神經母細胞瘤中SPR的表達與腫瘤的惡性程度以及一些神經母細胞瘤相關腫瘤基因的表達呈正相關，而SPR抑制劑可以抑制神經母細胞瘤細胞的增殖[5]。同樣地，Nature雜志2018年報道證實了SPR抑制劑能夠顯著地抑制細胞的增殖[6]。最新，本團隊首次證實SPR能促進肝癌細胞增殖，其表達與肝癌患者的不良預后密切相關[7]；同時，也發現SPR在結直腸癌組織中顯著高表達，研究證實SPR通過調控結直腸癌細胞增殖和轉移，從而促進結直腸癌惡性進展。總之，SPR可能作為多種腫瘤不良預后的潛在指標，是潛在的抗腫瘤新靶點。因此，本研究擬篩選SPR的小分子抑制劑，以期為腫瘤治療提供可能的治療新方案。

天然產物，毫無疑問是藥物開發的寶庫。2020年美國國立衛生研究院(NIH)發表題為“Natural Products As Sources of New Drugs”的綜述指出近四十年間所有上市的抗腫瘤藥物，大約50%的藥物是天然產物或衍生于天然產物[8]。目前，已發現數萬的天然小分子化合物，不少報道具有抗腫瘤活性。為此，我們擬篩選SPR天然產物小分子抑制劑。傳統上，篩選靶點的小分子抑制劑，需花費大量資金獲得實體藥物后，先逐一進行酶學水平篩選，隨后進行體內外驗證。這種藥物篩選過程，存在耗時長、成本高、效率低等問題。于是，越來越多的研究機構開始采用“人工智能”藥物設計篩選體系[9]，將基于機器學習技術來模擬小分子化合物的藥物特性，從而挑選出最有希望的模擬化合物進行合成和實驗。2019年7月，全球首個基于“人工智能”獲得的藥物問世，并批準進入臨床試驗階段[10]。今年，新型冠狀病毒肺炎席卷全球，我國科學家在極短的時間內基于“人工智能”篩選出一批候選藥物，這為它們成功地應用于臨床提供了有力的科學支撐，其中，多個天然化合物也被篩選為候選藥物[11]。可見，“人工智能”藥物篩選，將有助于天然產物的有效開發利用。然而，天然產物的藥理作用機制往往具有“多層次、多途徑、多靶點”的特性，這給它們開發研究增加了巨大的困難。2007年，英國藥理學家Hopkins首次提出“網絡藥理學”的概念[12]。它是指通過生物學網絡中節點的連接和關系來分析網絡特性，從而闡明藥物作用機制。“網絡藥理學”與天然產物的藥理作用機制復雜的特點不謀而合，在天然產物的作用機制研究中大量應用，已成為當前的研究熱點[13]。今年，在中醫藥抗擊新型冠狀病毒肺炎中，“網絡藥理學”為諸多中藥的臨床應用及時地提供了一定的科學支撐[14-16]。所以，“網絡藥理學”符合天然產物藥理作用機制的特性，將為其機制研究指明方向，提高研究效率。

因此，我們將針對SPR開展天然產物小分子抑制劑的篩選研究，擬通過“人工智能”藥物篩選，從成千上萬個天然產物中獲得數十個最佳候選小分子(圖1)。同時，針對SPR候選的天然產物小分子抑制劑，借助“網絡藥理學”對天然化合物、作用靶點和不同途徑的相互作用網絡進行分析研究，以期初步闡明其抗腫瘤作用機制，為后續體內外機制探究，指明了方向。總之，本團隊依托“墨蝶呤還原酶促進結直腸癌進展的作用機制及其抑制劑發現的研究”項目為SPR天然產物小分子抑制劑的研究，奠定了一定的工作基礎。這將為后續深入開展酶學、細胞水平和動物水平的評價減少了盲目性，極大降低研發成本和工作量，有望提高研發效率，還能為天然產物小分子抑制劑的研究開發提供啟示。

圖1 研究方法思路圖

1 材料與方法

1.1 天然產物小分子數據庫的建立

搜集中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)、Selleck Chemicals天然產物庫(https://www.selleck.cn/)、Med Chem Express天然產物庫(https://www.medchemexpress.cn/)和Target Mol天然產物庫(https://www.tsbiochem.com)等平臺的天然小分子化合物。下載化合物的三維結構，建立用于“人工智能”藥物篩選的天然產物小分子數據庫。應用openbabel(版本號2.4.1)軟件將全部天然產物單體分子(MOL2格式)轉換成pdbqt格式用于分子對接。

1.2 “人工智能”藥物虛擬篩選方法

SPR的晶體結構從RCSB蛋白數據庫(PDB ID：4z3k)下載。去除晶體結構內的小分子結構和結晶水分子，轉換成pdbqt格式，然后將分子對接空間最大化。以此SPR蛋白胞結構與天然產物小分子結構進行分子對接(Autodock vina對接軟件(版本號4.2))，選擇結合自由能小于-14kcal/mol的天然產物小分子，以“三重積分協同過濾計分系統”(人工智能篩選系統)判斷天然產物小分子的結合位置，計算位置分數較高的候選天然產物若干個。

其中，“人工智能”藥物設計篩選體系，將基于機器學習技術來模擬小分子化合物的藥物特性，比如靶點結合能力和特異性，藥物動力學和藥物代謝特性，以及毒副作用，從而挑選出最有希望的模擬化合物進行合成和實驗，提高篩選效率，從而節省時間和金錢。本研究中用到的“三重積分協同過濾計分系統”(人工智能篩選系統)由國家南京新藥篩選中心(中國藥科大學)江經緯副研究員基于“協同過濾算法(collaborative filtering)”自行編程設計，詳見團隊已發表文章[17]。協同過濾算法是對小分子抑制劑行為數據的挖掘，發現抑制劑的偏好，基于不同的偏好對抑制劑進行群組劃分并推薦行為相似的候選抑制劑的著名推薦算。利用該系統，團隊已經成功篩選出PD-1/PD-L1的小分子抑制劑[18]、p53變構劑[19]和VSIG3小分子抑制劑[20]等多個候選的藥物，并成功獲得或申報了國家專利。

1.3 化合物-靶點網絡的構建

根據“人工智能”藥物篩選得到1783個候選小分子化合物，綜合考慮結合能，口服生物利用度(OB)(大于20%)，類藥性(DL)(大于0.7)和文獻報道等指標，選擇最佳化合物基于SwissTargetPrediction數據庫(SIB，http://www.swisstargetprediction.ch)和STITCH數據庫(http://stitch.embl.de)等獲得其潛在靶點，將Probability在0.3及以上的243個靶點作為其候選的作用靶蛋白。隨后，將這些篩選出的作用靶蛋白通過Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)規范其名稱，再將規范后的靶點導入STRING(https://string-db.org/)數據庫，就可以獲得“化合物-靶點”相互作用信息。接下來，下載互作信息文件導入Cytoscape軟件(版本號3.6.0)，在軟件Network Analyzer插件里即可進行藥理作用機制網絡分析，篩選degree大于2的100個蛋白作為其關鍵靶點。最后，在Cytoscape軟件中構建化合物-靶點的網絡機制圖。

1.4 靶點富集分析

在DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov)中，選擇人源靶點，導入上述篩選的靶點信息，進行KEGG信號通路分析和GO富集分析。最后，將分析的數據整理后，即可利用R語言和Cytoscape軟件對網絡進行可視化。

2 研究結果

2.1 SPR天然產物小分子抑制劑“人工智能”藥物篩選模型的建立

首先選擇SPR的原底物墨蝶呤和已報道的抑制劑(吲哚美辛(Indomethacin，Indocin)、蘆丁(Rutin)、磺胺吡啶(Sulfapyridine，SFD)和磺胺噻唑(Sulfathiazole，SFZ))進行了“人工智能藥”物篩選模型測試。結果顯示，其最優結合能在-8.0 kcal·mol-1左右。它們與SPR蛋白結構的作用位點和相互作用模式見表1和圖2。下一步，利用該“人工智能”藥物篩選模型，進行SPR天然產物小分子抑制劑虛擬篩選。

圖2 原配體和已報道陽性藥物與SPR的對接模式

表1 原配體和陽性藥物與SPR的對接數據

2.2 SPR天然產物小分子抑制劑“人工智能”藥物篩選結果

首先，經過“人工智能”虛擬篩選，共有1783個天然小分子化合物的最優結合能小于原配體和陽性抑制劑(-8.0 kcal·mol-1左右)，表明這些化合物與SPR結合能力較強。然后，選擇結合自由能小于-14 kcal·mol-1的天然產物小分子，以“三重積分協同過濾計分系統”(人工智能計分系統)判斷天然產物小分子的結合位置，篩選出位置分數較高的20個候選天然產物小分子化合物(圖3)。這些化合物的分子量在400-500左右，主要是三萜和甾體類。其中，預測活性最強的6個天然小分子化合物最優結合能均小于-17 kcal·mol-1，類藥性(DL)均遠大于0.18這個常用閾值(表2)。預測活性最強的是山楂酸(Maslinic acid)，結合能為-18.4 kcal·mol-1，結合位點是ARG14，GLY15，PHE16，GLY17，ASN97，ILE152，PRO195，GLY196，PRO197，LEU198，THR200，MET202，GLN203(圖4)。山楂酸在大棗、覆盆子、金櫻子和枇杷葉等常見中藥材的主要活性成分之一。其次是刺囊酸(Echinocystic acid)，它的 結 合 能 是-18.2 kcal·mol-1，結 合 位 點 是GLY11，ARG14，GLY15，PHE16，GLY17，ASN97，ILE152，SER153，PRO195，GLY196，LEU198，THR200，ASP201，MET202(圖4)，它在紫菀、大皂莢、墨旱蓮、皂角刺和豬牙皂等藥用植物中均有發現。此外還有常見草藥雷公藤中的雷公藤紅素(Celastrol)、積雪草中的羥基積雪草酸(Madecassic acid)和積雪草酸(Asiatic acid)以及莪術中的常春藤皂苷元(Hederagenin)等活性成分，也具有較強的SPR抑制作用。總之，這些天然產物可能是SPR的有效小分子抑制劑。

圖4 預測活性最強的前6個SPR天然產物小分子抑制劑與酶的對接模式

表2 預測活性最強的前6個SPR天然產物小分子抑制劑與SPR的對接數據

圖3 預測活性最強的前20個SPR天然產物小分子抑制劑

2.3 SPR天然小分子抑制劑，刺囊酸的抗腫瘤網絡作用機制

基于上述“人工智能”藥物篩選和“計算機分子對接”，篩選出SPR的最佳潛在天然小分子抑制劑可能是山楂酸、刺囊酸、雷公藤紅素、羥基積雪草酸、積雪草酸和常春藤皂苷元等天然產物。綜合考慮結合能量、口服生物利用度(OB)和類藥性(DL)等指標，下一步我們將重點評價三個篩選指標均最高的刺囊酸的抗腫瘤作用，并探究其抗腫瘤作用機制。因此，我們對刺囊酸展開了“網絡藥理學”作用機制探索研究，以期為后續研究指明方向。

2.3.1 刺囊酸靶點-靶點網絡圖構建

將刺囊酸得到的相關靶點100個，導入STRING數據庫中，得到PPI網絡關系圖。PPI中有邊(edge)418條，節點(node)97個，平均度(degree)值8.62。將相關靶點導入Cytoscape軟件中，構建PPI圖(圖5)。網絡中節點由藍色向紅色轉變表示靶點相關性成正比，網絡節點的度表示網絡中和節點關聯的邊的數目。連接靶點較多的節點在整個網絡中起到可能為樞紐蛋白。結果顯示刺囊酸前5個關鍵靶點可能是SRC(rous sarcoma oncogene，勞斯肉瘤癌基因)(node：SRC；degree：45；Betweenness Centrality：0.202)，ESR1(estrogen receptor 1，雌 激 素 受 體1)(node：ESR1；degree：35；Betweenness Centrality：0.095)，PPARA(peroxisome proliferator activated receptor alpha過氧化物酶體增殖物激活受體ɑ)，(node：PPARA；degree：31；Betweenness Centrality：0.125)，TP53(tumor protein p53，腫瘤抑制蛋白53)，(node：TP53；degree：30；Betweenness Centrality：0.0702)，PPARG(peroxisome proliferator activated receptor gamma，過氧化物酶體增殖物激活受體γ)，(node：PPARG；degree：29；Betweenness Centrality：0.01)。

圖5 刺囊酸的靶點-靶點網絡圖(PPI)

2.3.2 刺囊酸相關靶點的富集分析

2.3.2.1 GO富集分析

將得到的靶點導入DAVID數據庫中，進行GO富集分析，富集分析結果包含3個部分，分別為生物學過程(Biological Process，BP)(94個基因)、細胞組成(Cellular Component，CC)(95個基因)和分子功能(Molecular Function，MF)(95個基因)。以P＜0.05為閾值，采用Count值排序，分別篩選出前10個條目，繪制氣泡圖。見圖6，其中縱坐標為GO條目名稱，橫坐標和氣泡大小為相關基因數Count值，顏色以-log10(PValue)代表。富集結果表明刺囊酸可能涉及到的生物學過程(Biological Process，BP)主要有RNA聚合酶II啟動子的轉錄起始(transcription initiation from RNA polymerase IIpromoter)，細胞增殖的調控(regulation of cell proliferation)和G蛋白偶聯受體信號途徑(G-protein coupled receptor signaling pathway)等(圖6A)。涉及細胞組成(Cellular Component，CC)主要有質膜(plasma membrane)，膜的組分(integral component of membrane)和胞漿(cytosol)等(圖6B)。涉及分子功能(Molecular Function，MF)主要有蛋白結合(protein binding)，鋅離子結合(zinc ion binding)和類固醇激素受體(steroid hormone receptor activity)等(圖6C)。

2.3.2.2 KEGG富集分析

將得到的靶點導入DAVID數據庫中，進行KEGG富集分析，以P＜0.05為閾值，采用Count值排序，分別篩選出前10個條目，繪制氣泡圖。其中縱坐標為信號通路名稱，橫坐標和氣泡大小為相關基因數Count值，顏色以-log10(PValue)代表。富集結果表明，刺囊酸涉及多條與腫瘤相關的信號通路。包括癌癥信號通路(Pathways in cancer，Count：19)，癌癥中的蛋白多糖信號通路(Proteoglycans in cancer，Count：9)和PPAR信號通路(PPARsignaling pathway，Count：9)等(圖6D)。

3 討論

天然藥物來源于動物、植物、微生物和礦物，尤其以植物來源為主。自古至今，天然產物在人類與疾病斗爭的過程中，發揮了巨大的作用。先后有嗎啡、阿司匹林、喜樹堿、紫杉醇和青蒿素等藥物被批準應用，它們直接來源于植物或衍生于植物藥[8]。近年來，美國食品藥品監督管理局繼續批準了巨大戟醇甲基丁烯酸酯、高三尖杉酯堿和Crofelemer等天然藥物應用于臨床[8]。目前，已發現的天然藥物多達數萬，不少報道具有廣泛的藥理活性。然而，絕大部分化合物靶點未知，作用機制不明確，嚴重阻礙它們有效地開發利用。

本團隊基于前期文獻調研和實驗證實，SPR可作為白血病、膠質瘤、肝癌和腸癌等多種腫瘤不良預后的指標，是新的抗腫瘤靶點[2]。為此，我們擬針對SPR，開發天然產物小分子抑制劑。首先，我們整合多個平臺數據，構建了天然產物小分子虛擬數據庫。隨后，通過“人工智能篩選”在短時間內就從成千上萬個化合物中，成功篩選出了20個最佳的候選天然產物小分子抑制劑。進一步地，重點考察了山楂酸、刺囊酸、雷公藤紅素、羥基積雪草酸、積雪草酸和常春藤皂苷元等6個天然產物，結果顯示它們的結合均能遠低于已報道的抑制劑，而且類藥性也遠大于常用閾值，顯然它們將是SPR抑制劑開發的重點研究對象之一。因此，“人工智能”SPR天然小分子抑制劑的篩選，能極大縮小了候選化合物的篩選范圍，有望提高研發效率和成功率。

基于“人工智能”藥物篩選的結果，我們又綜合考慮結合能量、口服生物利用度和類藥性等指標，進一步地選取次囊酸作為研究對象，開展網絡藥理學分析。利用數據庫得到次囊酸相關靶點100個，構建靶點-靶點圖(PPI)，根據關鍵靶點排序中發現多個靶點均與腫瘤有相關性。已有研究表明，SRC是受體結合后激活的主要激酶之一，在其它蛋白酪氨酸激酶(PTK)家族的激活中起作用，SRC激酶在一些腫瘤組織和腫瘤細胞系如結腸癌細胞中的活性增加[20]。TP53在許多腫瘤類型中起抑癌作用，根據生理環境和細胞類型誘導生長停滯或凋亡，TP53在大約60%的癌癥中經常發生突變或失活，與癌癥具有很強的相關性[21]。對次囊酸關鍵靶點富集分析，GO富集分析發現，次囊酸可能對RNA聚合酶II啟動子的轉錄起始，細胞增殖的調控和G蛋白偶聯受體信號途徑起調節作用，這些生物學過程通過影響諸多信號通路的傳導，控制腫瘤細胞中基因的轉錄和翻譯，從而調控蛋白質的合成與穩定性，最終調節腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移等一系列的生理病理過程。進一步KEGG富集分析發現，排在第一位的是腫瘤信號通路(Pathways in cancer)，還涉及到癌癥中的蛋白多糖信號通路(Proteoglycans in cancer)等。由富集結果表明，次囊酸可能通過干預多條與腫瘤相關的通路，從而發揮抗腫瘤作用。

因此，本研究一方面通過“人工智能”藥物篩選，獲得了山楂酸、刺囊酸、雷公藤紅素、羥基積雪草酸、積雪草酸和常春藤皂苷元等數個候選的SPR天然產物小分子抑制劑。另一方面，基于“網絡藥理學”研究，揭示了代表SPR抑制劑刺囊酸的藥理作用機制。雖然，“人工智能”藥物篩選和“網絡藥理”作用機制研究，只能初步地篩選出候選藥物和揭示其作用機制，還需要進一步地借助細胞分子生物學、動物實驗和臨床試驗進行確證。但是，這些結果有望為后續SPR抑制劑的篩選評價，縮小篩選范圍，極大地提高成功率；同時，還可能為候選藥物的作用機制探究，明確方向，顯著提高研究效率。總之，本研究期望為天然產物小分子抑制劑的研究開發，提供思考和啟示。