代謝組學在中醫證型中的應用探析＊

胡星遙，劉紅寧，嚴小軍，張 潔，尚廣彬

(江西中醫藥大學中醫基礎理論分化發展研究中心/江西省中醫病因生物學重點實驗室 南昌 330004)

代謝組學著眼于揭示生物體內相對分子量小于1000的代謝物變化情況，并對代謝物進行定量和定性分析研究，廣泛應用于生物醫學領域，是系統生物學的組成部分，同時也是精準醫學用于疾病早期診斷的主要方法[1,2]。代謝組學的分析技術包括核磁共振(NMR)和液相色譜質譜(HPLC-MS，UPLC-MS/MS)、氣相色譜質譜(GC-MS，GC-MS/MS)、液相-核磁-質譜(HPLC-NMR-MS)、電泳-質譜(CE-MS)、以及等離子體質譜(ICP-MS)等聯用技術[3-6]。其常用的生物學樣本有血液、尿液、組織、腦脊液、頭發、唾液、糞便和呼出氣體等[7-10]，具有待測樣品損失小、樣品處理高通量、代謝物易檢出、檢測結果信息量大等優勢[11]。在醫學研究中，代謝組學技術常與轉錄組學、蛋白組學、基因組學等其他技術聯合應用，辨析病理性反應過程中形成的相關代謝產物，鑒定出有顯著變化的代謝物，并分析它們之間的整體關聯性，對疾病發生發展中的關鍵途徑進行分析闡釋，探索疾病的病因生物學機制，有助于開創新的疾病診療模式[12-14]。

近年來，中醫證型標準化研究的成果頗豐，代謝組學技術已成為中醫證侯學研究的新技術[15]。中醫證型包含了病因、病位、病性以及病勢的關系，是疾病發展過程中某一階段的病理性概括，是機體受不同的內外環境影響而引起體內氣血陰陽變化，從而導致機體呈現出不同的疾病狀態，且隨著疾病的發生發展而發生相應的變化[16]。辨證論治是中醫診治疾病的特殊方法，是指導中醫臨床正確辨證分型、合理用藥治療疾病的基本原則[17]。然而，由于中醫證型的診斷要審時度勢，根據患者體征和癥狀的不同，依據不同醫生的臨床經驗、不同版本的教材和診療指南等進行辨證分型，主觀性較大，故其診斷的量化和客觀化、證候的規范化和標準化研究是難點和重點。而代謝組學具有整體性、動態性的特點，與中醫的整體觀、辨證論治的特性相吻合，差異代謝物可以探查致病因素作用于機體后內環境的變化情況，是對整體病程中某一階段的病理性變化的客觀反映[18]。將兩者相結合，糅合成中醫證候代謝組學研究技術，即在對疾病進行中醫辨證分型后采集生物學樣本，通過代謝組學的方法找出中醫不同證型間的標志性代謝物及其所在的相關代謝通路，以明確不同證型間相關物質的變化，確定中醫證型相關代謝譜群，為中醫藥理論客觀性研究提供新的方法和思路[19,20]。

1 代謝組學在五臟疾病中醫證型中的研究

在中醫基礎理論中，人體生命活動的動力是元真之氣，《素問·平人氣象論》中有云：“臟真散于肝，肝藏筋膜之氣也……臟真通于心，心藏血脈之氣也……臟真濡于脾，脾藏肌肉之氣也……臟真高于肺，以行榮衛陰陽也……臟真下于腎，腎藏骨髓之氣也。”表明人體的五臟調和離不開真氣的充沛，它是五臟維持正常生理功能的物質基礎和能量基礎[21]。現代醫學研究表明[22]，中醫證型均涉及多指標、多系統、多層次的物質變化，五臟之間有共同的遞質、激素、細胞因子等傳遞信息的物質，對人體各系統、器官、組織、細胞進行代謝調節。從整體觀而言，代謝組學技術能夠從微觀層面分析和探討五臟各自的生理功能和病理特點，把握疾病的整體變化，探索五臟疾病中醫證型的衍變機制。

1.1 肝系疾病中醫證型的代謝組學研究

現代醫學的肝硬化、肝腹水、肝炎、肝癌等屬于中醫肝系疾病“積聚”“鼓脹”“脅痛”以及“肝癌”等范疇。肝者主疏泄、主藏血。若疏泄不暢，易致肝郁、肝陽上亢等證；若藏血不佳，易致肝血虛、肝腎陰虛等證。周玄等人的研究顯示[23]，肝系疾病中具有診斷潛能的生物標記主要集中在脂類、氨基酸類和膽汁酸類等物質。

代謝組學技術在肝硬化、黃疸、肝炎臨床常見肝系疾病應用較多，Song等[24]利用代謝組學方法對扶正化瘀方改善肝硬化的機制研究中發現肝腎陰虛證患者體內排毒能力和對谷胱甘肽代謝的調節能力均有所增強，表明扶正化瘀方治療此證型患者的機制可能涉及抗氧化劑途徑的調節和自由基的清除。而肝郁證患者出現能量代謝途徑顯著變化，表明扶正化瘀方治療肝硬化肝郁證的機制存在糖酵解和脂肪酸代謝的調節。Wang等[25]對黃疸不同證型患者的代謝組學研究結果顯示區別陽黃證患者與健康人的內源性代謝物主要有激動素、膽色素原、吲哚丙烯酸等，參與的代謝途徑主要涉及維生素B6(Vitamin B6)代謝，色氨酸、脯氨酸和精氨酸代謝；區別陰黃證患者與健康人的內源性代謝物主要有2-辛烯二酸(2-octenedioic acid)，焦谷氨酸，α-N-苯基乙酰基-1-谷氨酰胺(α-N-phenylacetyl-1-glutamine)等，參與的代謝途徑主要涉及類固醇激素和原代膽汁酸生物合成，半胱氨酸和蛋氨酸代謝。李維薇等[26]對嬰兒巨細胞病毒肝炎不同證型的代謝組學進行探討，研究提示脾虛濕困證患兒出現丁酸、馬尿酸、氨基丙二酸、3-氨基異丁酸(3-Aminoiseobutyric acid)等腸道菌群相關的代謝物紊亂；濕熱內蘊證患兒出現檸檬酸、D-麥芽糖(D-Maltose)和D-葡萄糖(D-Glucose)等能量相關代謝物紊亂；氣滯血瘀證患兒除了出現氨基酸代謝通路之外，還存在檸檬酸循環、乙醛酸和二羧酸代謝等能量相關代謝通路的異常。

1.2 心系疾病中醫證型的代謝組學研究

現代醫學的冠心病、高血壓病、高脂血癥等屬于中醫心系疾病“心悸”“眩暈”等范疇。心者主血脈、主神明。若心血不足、心脈不通，易致心血虛、痰凝血瘀等證；若藏神不佳，易致心腎不交、心火亢盛等證。心系疾病的發生機制主要涉及糖代謝、脂代謝、氨基酸代謝和部分能量代謝[27]。

代謝組學在冠心病中的研究主要集中在痰凝血瘀證和氣陰兩虛證等證，在高血壓病的研究主要是肝陽上亢證和痰濕壅盛證等證，在血脂異常癥的研究主要是腎陽虛證和痰濕阻滯證等證。不同證型的冠心病代謝組學研究表明[28]：痰凝血瘀證患者糖代謝明顯增加，主要涉及賴氨酸降解；氣陰兩虛證患者機體中的肌酐和琥珀酸含量明顯降低，能量代謝紊亂，原因是三羧酸循環受到抑制，涉及的主要通路為色氨酸、精氨酸和脯氨酸代謝。韋桌等[29]基于文獻計量學研究發現高血壓肝陽上亢證形成過程涉及氨基酸的轉運和氧自由基的清除，以及維生素、蛋白質、一氧化氮、多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素等物質的合成。此外，吳天敏等[30]的研究發現在中青年高血壓痰濕壅盛證病人體內出現了氨基酸、脂蛋白和糖代謝異常。利用該研究結果，通過代謝組學技術方法能準確、快速的從普通人群或高血壓患者中鑒別出痰濕壅盛證高血壓病人。不同證型血脂異常癥的代謝組學研究顯示[31]：腎陽虛證和痰濕阻滯證患者谷氨酰胺、膽堿、丙氨酸和谷氨酸濃度均低于健康對照組，在氧化與炎癥反應、肝臟和能量代謝等方有差異，涉及了丙酮酸代謝途徑和甘油酯代謝途徑，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝途徑，谷氨酰胺和谷氨酸代謝途徑，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝途徑。其中，腎陽虛證患者的關鍵代謝物有甘氨酸和絲氨酸，差異性代謝途徑有甘油酯代謝；痰濕阻滯證患者關鍵代謝物有谷氨酰胺、纈氨酸和異亮氨酸，差異性代謝途徑有甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸代謝。

1.3 脾系疾病中醫證型的代謝組學研究

現代醫學的胃炎、腹瀉、胃癌和腸癌等屬于中醫脾系疾病“胃痛”“痞滿”“泄瀉”以及“胃癌”和“腸癌”等范疇。脾者主運化、主升清、主統血。若運化不利，易致脾虛水泛、痰濕壅盛等證；若清陽不升，易致脾氣虛、脾氣下陷等證；若統血不佳，易致肝脾不和、心脾血虛等證。脾主運化的功能與糖代謝、脂代謝、能量代謝密切相關[32]。

代謝組學技術在對脾系疾病中應用集中在脾胃濕熱證、脾胃虛寒證、脾虛證等。慢性萎縮性胃炎代謝組學研究結果顯示脾胃濕熱證中乳果糖、纈氨酸含量的水平比脾胃虛寒證高，但其肌肽、甲酸和異丁酸的含量低于脾胃虛寒證中的含量，表明慢性萎縮性胃炎的兩種證型在脂代謝、糖代謝、核酸和氨基酸代謝方面有差異[33]。在結直腸癌術后研究中，利用代謝組學技術可以區分濕熱浸淫證、脾虛證、肝腎陰虛證。其中，肌酐和氨基酸升高可能與濕熱浸淫證的形成有關；D-色氨酸(D-tryptophan)降低可能與脾虛證相關；在肝腎陰虛證中，則表現為D-半乳糖(D-galactose)增加，而1，2，3-丙三羧酸(1，2，3-propanetricarboxylic acid)、L-脯氨酸(L-proline)和2-吲哚羧酸(2-indolecarboxylic acid)減少[34]。

1.4 肺系疾病中醫證型的代謝組學研究

現代醫學的哮喘、肺結核、肺炎、肺癌等屬于中醫肺系疾病“哮病”“肺癆”“喘病”以及“肺癌”等范疇。肺者主氣、主行水、主治節、主宣肅。若氣機不暢、宣肅不順，易致肺氣虛、肺陰虛、肝火犯肺等證；若行水不利、治節不佳，易致痰濁阻肺、濕熱蘊肺等證。肺的宣發肅降功能和氨基酸代謝、脂代謝、能量代謝息息相關[35]。

代謝組學技術在肺癌實證和虛證、支氣管哮喘肺虛證和腎虛證等研究中應用較多。Ma等[36]對非小細胞肺癌不同證型進行代謝組學研究顯示：實證組與虛證組有10個化合物差異顯著，以乳酸、肌醇、葡萄糖和磷酸膽堿最為敏感，其中實證組谷氨酰胺、纈氨酸和葡萄糖含量比虛證組高；虛證組乳酸、肌醇、檸檬酸、丙酮酸、丙氨酸以及磷酸膽堿和甘油磷酸膽堿含量較實證組高。在對支氣管哮喘緩解期中醫證型的代謝組研究中發現肺虛組和腎虛組能有明顯的差異。腎虛組血漿中的纈氨酸、亮氨酸、檸檬酸、丙氨酸、乳酸、肌酸等代謝物相較肺虛組顯著下降；乙酰乙酸和丙酮等代謝物含量則顯著增加，這些差異與哮喘的氣道過敏、炎癥和重塑密切相關[37]。

1.5 腎系疾病中醫證型的代謝組學研究

現代醫學的腎病、腎炎、腎癌等屬于中醫腎系疾病“水腫”以及“腎癌”等范疇。腎者藏精、主水、主納氣。若不能藏精納氣，易致腎不納氣、腎精虛等證；若水液運行失常、津液代謝失司、陰陽失調，易致風水泛濫、肝腎陰虛、脾腎陽虛、腎陰陽兩虛等證。代謝組學研究中發現，腎病患者的鞘脂類、類固醇類、膽紅素循環等代謝通路有異常[38]。

將代謝組學技術應用在慢性腎病脾腎氣虛證和脾腎陽虛證、兒童紫癜性腎炎熱傷腎絡證中，可以挖掘出如下信息：慢性腎病脾腎氣虛證和脾腎陽虛證的代謝產物有顯著性差異，其主要差異標記物有氨基酸、鞘脂類、脂肪酸等，主要涉及氨基酸代謝、鞘脂類代謝、脂肪酸代謝等[39]。針對兒童紫癜性腎炎的熱傷腎絡證進行代謝組學研究，其差異標志物中，醛固酮、同型半胱氨酸硫內酯、均聚L-精氨酸(Homopoly-Larginine)升高，苯丙精氨酸、色氨酰蛋氨酸、L-蛋氨酸(L-methionine)和雌酮降低[40]。

表1展示了代謝組學在五臟疾病中醫證型中的部分研究結果，主要是利用代謝組學技術對病人和健康人，以及某疾病的不同證型進行鑒別，以此可探究疾病狀態下不同證型的發病機制。除此之外，亦有對中醫藥治療疾病的療效進行代謝組學的研究，可為中醫選方配藥的合理化和整合化提供啟發性的指導。當然，目前研究過程中存在中醫證型的樣本量較少，存在著辨證的差異性以及檢測的誤差等缺陷，故而仍需要進一步反復的深入研究來驗證。

1.6 中醫證型中常見代謝通路的研究

常見的代謝通路有糖代謝、脂代謝、氨基酸代謝等，結合中醫證型的代謝組學研究結果發現特定的生物標記群作為中醫證型的鑒定輔助，這些代謝通路的異常亦可以解釋不同中醫證型發生發展的機制，為疾病診療帶來新的風向標。

糖為水谷之精微，是機體生命活動不可或缺的物質，由脾運輸，疏布于心肺，經肝貯藏，腎代謝[41]。若在糖代謝過程中，某一代謝環節出現異常，可反映出某個或某些臟器出現疾患，糖代謝的異常也能加快疾病的進展。研究顯示[42]非小細胞肺癌中痰瘀毒結型復發率最高，糖代謝異常能促使細胞侵襲轉移的能力增強，導致余毒死灰復燃、癌毒走竄復發。由此可見，改善糖代謝可以成為治療痰瘀毒結型非小細胞肺癌一種治療策略。脂質涉及了機體大量生物學結構的組成，參與了人體各種功能的正常發揮，并能在細胞中保持動態平衡，脂代謝異常已被證明與各種常見的代謝性疾病密切相關[43]。研究證實[44]非酒精性脂肪肝肝郁脾虛證中糖代謝障礙會使葡萄糖利用率下降，脂代謝障礙導致肝臟脂肪沉積增多，糖脂貯積加重了痰濕的瘀積，致使肝氣之郁，脾氣不行。氨基酸作為蛋白組的基本單位，是氨基和羧基的有機化合物[45]。氨基酸代謝的紊亂會嚴重影響機體的新陳代謝，打破營養輸入、合成與能量需求、供給之間的平衡[46]。有研究報道指出[47]抗生素相關性腹瀉脾陽虛證與糖代謝、脂代謝、氨基酸代謝等代謝通路的異常相關，機體能量供給不足，故出現活動減弱等陽氣不足的現象。

2 代謝組學在動物模型中醫證型中的研究

在現代醫學動物實驗中發現，雖然人和動物的機體、機理有所不同，但對動物模型中醫證型進行研究并不是為了單純的復制人類疾病的中醫證型，主要目的是探索中醫證型的發生機制，以期更好的服務于臨床疾病的辨證施治。因此，許多研究者應用代謝組學的技術研究動物模型中醫證型，已然取得了一定的成效。

代謝組學在動物模型中醫證型的研究存在以下特征[48]：①實驗動物大多有品種、雌雄、年齡、體重等不同，但最多選用的實驗動物是雄性大鼠；②中醫證型的造模方法存在差別，即使是同種中醫證型模型，研究結果亦略有不同；③代謝組學的技術平臺、待檢測樣本有所不一，超高壓液相色譜-飛行時間質譜聯用在代謝組學的分析技術中最常用[49]，中醫證型研究代謝組學樣本最常選取的是血液和尿液。不同分析技術會帶來結果的差別，但即便在同一實驗下不同樣本也會使代謝差異物不同[50]；④在不同實驗條件和方法下，對同一中醫證型進行研究：可以找到實驗結果相同的部分差異代謝標志物，這意味著對中醫證型研究的重復性是有意義的，有利于提高中醫辨證分型的統一化和標準化；⑤對不同時間段的代謝樣品進行檢測，或發現差異標各不相同，或有的同一差異標志物在不同時間會呈現相反的趨勢，有利于推進對中醫證型動態變化的研究。如表2所示，總結了部分動物模型中醫證型研究的代謝組學結果，其中包括實驗動物種類、中醫證型、檢測樣品、分析技術、主要的生物標志物和關鍵代謝途徑等。

表2 代謝組學在動物模型中醫證型中的研究特征

由表可知，①在動物模型中醫證型中與肝脾相關的證型，如肝陽上亢證、脾氣虛證等多涉及膽汁酸和脂肪酸代謝。膽汁為肝之余氣，膽汁排泄異常會影響肝臟和胃腸的正常生理功能，臨床研究表明肝硬化肝腎陰虛證患者的初級膽汁酸水平顯著升高，濕熱蘊結證患者的次級膽汁酸水平顯著升高，從改善膽汁酸代謝入手治療，可能對阻止肝硬化發展有意義[62]。②與血瘀有關的證型多出現氨基酸代謝和能量代謝紊亂的結果。徐利云的研究指出[63]與氣滯血瘀證相關性最高的是氨基酸代謝的異常，經藥物治療后氨基酸代謝紊亂可以得到改善，使因三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)合成不足導致能量代謝異常的情況得到緩解，使因能量運輸障礙導致氣血運行不暢的癥狀有所緩解。③與腎虛相關的證型中可見花生四烯酸代謝異常。腎臟中花生四烯酸代謝的調節，基于環氧合酶途徑、脂氧合酶途徑、細胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)途徑這3種代謝途徑，轉化為多種觸發腎臟不同炎癥反應的代謝物，這些代謝物通過自分泌和旁分泌產生的生物活性介質，來參與機體各種生理和病理過程[64]。

3 中醫證型中代謝組學與其他組學技術的結合

現代研究發現，多組學結合能夠提供更多的生物學信息。近年來，多組學結合應用在各個方面應用廣泛，但在中醫證型的研究中代謝組學與其他組學結合的研究仍相對較少。中醫證型研究的復雜性以及各種生物分子代謝產物表達的差異性，更使得許多中醫證型的調節機制和信號通路仍處于有待研究的階段。所以系統地整合從基因組學、轉錄組學、蛋白質組學等和代謝組學收集的信息，有利于探索中醫證型的發病機制，為未來的研究和臨床實踐尋找相關生物標志物、基因和蛋白等[65]。

3.1 中醫證型中代謝組學與蛋白組學聯合

Jiang等[66]報道了糖尿病腎陰虛證代謝組學和蛋白質組學的聯合分析，結果顯示腎陰虛證組中苯丙氨酸代謝、酪氨酸代謝、蛋白質和兒茶酚胺生物合成這三個細胞過程差異最顯著，主要涉及的代謝途徑有牛磺酸和牛磺膽酸代謝、甘氨酸代謝、絲氨酸和蘇氨酸代謝以及苯丙氨酸的代謝。張淼等[67]對艾滋病肺脾氣虛證進行代謝組學和蛋白質組學研究分析發現患者血清中甘油三酯和載脂蛋白A-II(Apolipoprotein AII，APOA-II)升高，鋅-α-2-糖蛋白1(Zinc alpha-2 glycoprotein 1，AZGP1)和載脂蛋白B(Apolipoprotein B，APOB)降低，表明艾滋病肺脾氣虛證患者存在脂代謝異常。閆清華[68]聯合代謝組學和蛋白組學分析，發現四君子湯對干預脾虛證均涉及了脂肪酸代謝。

3.2 中醫證型中代謝組學與基因組學聯合

汪洋[69]從代謝組學和基因組學出發，研究類風濕性關節炎脾虛證發現其潛在生物標記物有苯丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、丙酸，兩組學聯合分析表明在感染、炎癥、蛋白質代謝等通路上存在關聯。汪梅姣[70]應用代謝組學和基因組學技術探討痛風脾虛證，結果發現其潛在生物標記物有異亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸，兩組學聯合分析發現該病證主要改變集中于脂質代謝、藥物代謝、炎癥和免疫系統相關方面。

4 小結與展望

中醫施治注重整體觀，其多從宏觀角度出發去認識疾病，對微觀特征的細節描述客觀性欠佳。然西方醫學主要依賴于現代生物化學檢測技術，從微觀角度對疾病進行量化診斷。代謝組學在中醫證型中的研究，將兩者相結合，對不同中醫證型機體內的代謝物進行分析，找到不同證型的差異標志物，尋求共性，完善中醫辨證分型的微觀辨證，明確中醫證型的判別標準。在特定條件下，探究中醫藥對不同證型治療效果的定性定量研究或聯系疾病的病因和發病機制等開展代謝網絡的探索。

未來研究應注重對中醫證型開展深層次、多樣本、全方面的研究：一是以中醫基礎理論為中心思想，加強中醫證型的鑒定標準，以確立中醫證型的中西結合的動態化、規范化的診斷標準，明確疾病變化的機制；二是以現代醫學代謝組學技術為基礎，加強對大量樣本數據的挖掘，篩選不同證型的特異性代謝物，以提高中醫證型辨證分型的客觀化、科學化；三是代謝組學與其他組學技術和學科相結合來研究中醫證型，加強研究結果的說服力、可信度。四是在中醫證型動物模型的研究應逐漸完善各中醫證型動物模型的最佳造模法，包括動物選擇、方法結合、藥物配比、時間選定等各方面，以及模型成功的判定標準，建立起統一規范的中醫證型動物模型造模方法和標準體系。以期推動將科研成果轉化為臨床指導，進而更好的應用于疾病的辨證施治，為疾病診療提供新思路、新方法。