溫和灸對神經根型頸椎病大鼠ERS介導的神經細胞自噬與凋亡的影響＊

張 熙，粟勝勇，蔡慧倩，覃美相，黃小珍，黃 梅，代 琪，林 安

(1.廣西中醫藥大學研究生院 南寧 530001；2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院針灸科 南寧 530023)

神經根型頸椎病(cervical spondylotic radiculopathy，CSR)是頸椎病的常見類型，約占頸椎病發病的60%[1]，臨床上以神經病理性疼痛為主要表現[2]。研究證實[3]，神經病理性疼痛產生的重要原因之一是神經細胞自噬功能紊亂導致的細胞凋亡和壞死。研究表明，內質網應激(Endoplasmic Reticulum Stress，ERS)是介導細胞自噬與凋亡的重要途徑[4]，并且參與了神經病理性疼痛的誘發與維持[5]。ERS作為細胞的一種保護機制，其介導的細胞自噬可通過細胞內底物的分解代謝參與維持ATP的產生，進而回收、降解異常蛋白質和細胞器以維持細胞代謝平衡，減少細胞凋亡，修復受損神經[6]，而當刺激因素持續存在導致ERS表達過強時，自噬功能出現紊亂將導致細胞凋亡，加重神經病理性疼痛[7,8]。因此，調控神經細胞自噬水平，緩解內質網過度應激以減少細胞凋亡可能是緩解CSR疼痛的關鍵。

臨床研究證實[9，10]，采用艾灸療法治療CSR療效確切，具有良好的鎮痛效應，課題組前期研究亦證實[11]，艾灸療法可通過下調炎癥因子的表達，去除炎性刺激而治療本病，但基于ERS介導的神經細胞自噬與凋亡機制探討艾灸療法緩解CSR神經病理性疼痛的鎮痛機制研究仍缺乏。因此，本研究通過構建CSR大鼠模型，選取大椎穴進行溫和灸干預，觀察其鎮痛效應、自噬小體和細胞超微結構以及ERS標準性蛋白GRP78，ERS介導細胞凋亡的關鍵蛋白Caspase-12、CHOP表達的變化，探討溫和灸緩解CSR大鼠神經病理性疼痛可能的鎮痛機制。

1 材料

1.1 實驗動物及分組

SD大鼠40只，SPF級，體質量(250±20)g，雌雄各半，購自長沙市天勤生物技術有限公司(動物生產許可證號：SCXK湘2014-0011)。按照隨機數字表法將40只大鼠隨機分為：空白組、模型組、溫和灸組、溫和灸+3MA組4組，每組10只。實驗過程遵照《關于善待動物的指導性意見》執行。

1.2 試劑與儀器

①實驗主要儀器：YLS-3E型痛分析儀(北京眾實迪創科技發展有限責任公司)；離心機(Eppendorf，Centrifuge 5415D)；電泳儀(北京六一；DYCZ-24DN)；凝膠成像儀(天能，5200)；半干轉膜儀(ATTO，WSE-4040)；透射電子顯微鏡(hitachi，日本HT7700)；超薄切片機(Leica UC7，德國)。

②實驗主要試劑：一抗(Caspase-12：Bioss，BS-1105K；CHOP：Abcam，AB179823；GRP78：索萊寶，K106525P；β-actin：Abcam，AB8227)；山羊抗兔的二抗(北京中杉，ZB2301)；RIPA-PMSF裂解液(索萊寶，R0010)；上樣buffer(索萊寶，P1016)；TBST(索萊寶，T1081)；ECL發光液(Santa cruz，SC2048)；電鏡固定液(武漢谷歌生物，G1102)；3MA試劑、丙醇、無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)。

2 方法

2.1 造模及造模評價

①造模方法：除空白組外，其余3組大鼠參照竇夏睿氏法[12]進行造模，大鼠用10%水合氯醛按0.35ml/100g劑量腹腔內注射麻醉后，俯臥位固定，剃毛備皮充分暴露頸部，常規消毒后，手觸頸部第二胸椎棘突(T2)，由此向上于背部正中線做約3 cm切口，逐層鈍性分離皮下組織、頸后部肌群，使C6-T2左側椎弓得到充分暴露，刮凈其表面組織，用顯微鑷輕輕挑開C7和T1，C6和C7椎間隙的黃韌帶和結締組織，用尖嘴蚊式鉗輕輕鉗開C7左側椎弓，使脊髓暴露，將脊髓輕推至右側，再用顯微外科鑷將消毒后的尼龍漁線(直徑0.5 mm，長約1.5 cm)沿脊髓縱軸放至C6-7、T1神經根腋下，并避免過度下壓以損傷椎靜脈。操作完畢逐層關閉縫合傷口。②造模評價：于每日上午將術后大鼠放置于觀察箱內適應周圍環境30 min后觀察：有無自噬、舔咬、嘶叫等行為[13]；并結合Kawakami及Dubussion法[14]對大鼠因疼痛攣縮所引起的步態障礙進行評估，1分：大鼠左前肢無畸形，步態正常；2分：左前肢足內收蜷縮畸形，輕微持重或不持重、行走時跛行；3分：出現顯著的左前肢足內收蜷縮畸形，抬起、走動時不著臺面。

2.2 干預方法

①空白組：正常飼養，不做任何干預處理；處死時間同其他組；②模型組：每日抓取1次，予腹腔注射1 mL的生理鹽水，不做溫和灸干預處理；③溫和灸組：首先予腹腔注射1 mL生理鹽水；其次參照《實驗針灸學實驗指導》[15]選取大椎穴，刮凈毛發暴露穴位，選用南陽綠瑩艾草生物制品有限公司出廠的五年純艾條，點燃艾條一端，懸于大鼠大椎穴上方約3 cm處進行熏烤，每天1次，每次10 min，以大鼠皮膚出現紅暈為度。

④溫和灸+3MA組：首先腹腔注射1 mL 3MA(15 mg·kg-1生理鹽水稀釋)，其次進行溫和灸干預：操作同溫和灸組。

除空白組外，余3組均于造模成功后的第3天開始干預，連續干預7天后處死。

2.3 樣本采集及指標檢測

2.3.1 樣本采集

所有動物用10%水合氯醛腹腔注射過量麻醉致死，將壓線處C6-T1段脊髓及神經根組織(約1.5 cm*0.5 cm*0.5 cm)取出，根據脊髓節段和神經根分布分為2份，1份用0.9%冰凍氯化鈉溶液沖洗后放入凍存管，封口，液氮保存，用于Western Blot檢測；1份放入2%戊二醛中固定，4℃冰箱保存，待電鏡檢測。

2.3.2 指標檢測

(1)外周神經疼痛模型感覺功能的檢測

采用YLS-3E型痛分析儀(廠家：北京眾實迪創科技發展有限責任公司)檢測各組大鼠清醒狀態下的機械性痛閾。將測痛儀有機玻璃圓錐體鈍頭，放置于大鼠右后足足趾第3、4跖骨間，線性逐漸增大壓力，當大鼠嘶叫掙扎試圖抽回右后足時儀器自動記錄下的壓力值(g)即為大鼠的機械痛閾[16]。

(2)蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測脊髓及神經根組織Caspase-12、CHOP、GRP78的蛋白含量

取30 mg脊髓及神經根組織塊置于離心管中，加入200-400μL RIPA-PMSF裂解液將組織充分裂解，4℃下離心5 min，取上清采用BCA法測定蛋白含量。根據蛋白濃度加入相應體積的總蛋白與4×蛋白上樣buffer 100℃變性5-10 min。蛋白電泳：80 V恒壓電泳約20 min，待樣品進入分離膠層后，改用100 V恒壓電泳1-1.5 h；轉膜：200 mA恒流轉膜60-90 min。抗體孵育：用TBST配制8%脫脂奶粉作為封閉液，將膜放入封閉液中封閉3 h。按抗體說明書上的推薦比例使用封閉液將一抗(Caspase-12，CHOP，GRP78，β-actin)進行稀釋，將膜放入稀釋后的一抗中4℃孵育12 h。一抗孵育完成后，使用TBST洗膜3次，每次15 min。將膜放入按1：8000比例稀釋的二抗中37℃孵育1h，使用TBST洗膜3次，每次15 min，使用ECL顯色劑對膜進行顯色，于凝膠成像儀中進行曝光成像。

(3)透射電子顯微鏡檢測脊髓及神經根的自噬小體和超微結構變化

取體積不超過1 mm×1 mm×1 mm脊髓及神經根組織塊，經1%鋨酸磷酸緩沖液室溫(20℃)再次固定2 h，用酒精和丙酮逐級脫水，純812包埋劑包埋，60℃烤箱聚合48 h后，用超薄切片機進行切片(厚度約60-80 nm)，鈾鉛雙染色(2%醋酸鈾飽和酒精溶液，枸櫞酸鉛，各染色15 min)，鏡下觀察，采集圖像分析。

2.4 統計學處理

采用SPSS17.0統計軟件進行統計學處理。數據采用±s表示，多個樣本間的比較采用單因素方差分析，組間均數的兩兩比較采用LSD－t檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義的標準。

3 結果

3.1 各組大鼠行為學比較

造模后，大鼠左前肢出現足內收蜷縮、畸形、持重困難、懸空、跛行和舔舐等左前肢保護現象，與空白組比較，余3組步態評分明顯升高(P＜0.05)，提示造模成功。干預后，模型組上述癥狀無明顯變化，步態評分高于空白組(P＜0.05)；與模型組比較，溫和灸組、溫和灸+3MA組步態評分顯著降低(P＜0.05)，且溫和灸組下降更為明顯(P＜0.05)，提示溫和灸組能夠更好的改善大鼠步態障礙(圖1)。

圖1 各組大鼠步態評分比較(±s，10只鼠/組)

3.2 干預前后各組大鼠機械痛閾值比較

干預前，與空白組比較，模型組、溫和灸組、溫和灸+3MA組大鼠痛閾值明顯降低(P＜0.05)，3組組間比較無顯著性差異(P＞0.05)。干預后，與空白組比較，模型組大鼠痛閾值明顯降低(P＜0.05)；與模型組比較，溫和灸組及溫和灸+3MA組大鼠痛閾值明顯升高(P＜0.05)，且溫和灸組上升較為明顯(P＜0.05)，提示溫和灸組鎮痛效應優于溫和灸+3MA組(圖2)。

圖2 干預前后各組大鼠機械痛閾值比較(±s，10只鼠/組)

3.3 干預后各組ERS相關蛋白Caspase-12、CHOP、GRP78表達的比較

與空白組比較，模型組Caspase-12、CHOP、GRP78蛋白表達明顯上升(P＜0.05)，提示模型組大鼠內質網應激發生過度表達，其介導的細胞凋亡被激活。與模型組比較，溫和灸組Caspase-12、CHOP、GRP78蛋?白表達顯著下降(P＜0.05)，提示溫和灸可能通過緩解內質網應激水平，減少細胞凋亡；溫和灸+3MA組GRP78蛋白表達下降(P＜0.05)，Caspase-12、CHOP蛋白表達有所下降，但差異不具有顯著性(P＞0.05)。與溫和灸+3MA組比較，溫和灸組CHOP蛋白表達下降明顯(P＜0.05)，Caspase-12、GRP78蛋白表達有所下降，但差異不具有顯著性(P＞0.05)，表明，加入自噬抑制劑3MA后，ERS介導的細胞凋亡有所增加。見圖3。

圖3 干預后各組大鼠ERS相關蛋白Caspase-12、CHOP、GRP78表達的比較(10只鼠/組)

3.4 各組大鼠脊髓及神經根組織自噬小體及細胞超微結構的比較

透射電子顯微鏡下觀察，可見雙層膜將一小部分細胞質包裹而成的自噬小體；與其他3組比較，溫和灸組自噬小體多于其他3組，且胞質內細胞超微結構如細胞核、細胞器等較為完整，提示溫和灸干預可增加神經細胞自噬的表達水平。

圖4 各組大鼠脊髓及神經根組織自噬小體及細胞超微結構的比較(10只鼠/組，標尺=2μm)

4 討論

CSR的發病涉及頸項部“陽化氣”功能不足導致寒濕、瘀血等陰性病理產地堆積局部，阻滯經絡，導致經絡痹阻不通而產生疼痛，故在治療上當注重扶陽化氣以消陰翳。《神灸經論》言：“夫灸取于人，以火性熱而至速……能消陰翳”，本研究選取大椎穴進行溫和灸干預，可以起到溫補陽氣、散寒通路、化痰除濕、改善機體各項功能活動的作用，是“陽化氣”理論的直接體現。臨床研究證實[17-18]，采用艾灸療法治療CSR能夠有效的緩解其頸痛癥狀，具有較好的鎮痛效應。

內質網是真核細胞細胞質內的一種膜性細胞器，是細胞內蛋白質合成、翻譯后修飾、折疊、轉運以及鈣離子儲存與釋放的關鍵場所，在缺氧、炎性刺激、氧化應激等有害因素的刺激下，內質網穩態被打破，從而激活了ERS[19-20]。研究證實[21]，神經病理性疼痛與ERS介導的細胞自噬與凋亡密切相關。ERS時，細胞自噬作為蛋白質降解系統的重要組分，是一種重要的代償保護機制，其通過促進自噬體的形成回收、降解異常蛋白和細胞器以維持細胞代謝平衡，避免細胞的凋亡和壞死[22-23]；但如果ERS表達過強，未折疊或錯誤折疊的蛋白大量堆積超過自噬代償機制時，將導致細胞凋亡[6,24]，加重神經病理性疼痛[21]。因此，適度上調細胞自噬，緩解細胞內應激水平，減少細胞凋亡可能是緩解CSR神經病理性疼痛的重要機制。

GRP78生理狀態下廣泛分布，在內質網應激時迅速上調10-25倍，被認為是ERS激活的重要標志[25]；CHOP、Caspase-12是ERS介導細胞凋亡的兩條經典通路，CHOP通過抑制抗凋亡蛋白的轉錄、增加促凋亡蛋白的表達誘導細胞凋亡，是ERS與凋亡的主要中間信號分子[26]；Caspase-12僅在ERS時被激活，經過系列級聯反應后激活凋亡執行分子Caspase-3，誘導細胞凋亡[27]，是ERS誘導細胞凋亡的關鍵效應酶[28]。本研究以GRP78反映CSR模型大鼠內質網應激激活水平，以CHOP、Caspase-12反映其介導的細胞凋亡情況，研究結果顯示，CSR模型大鼠脊髓及神經根內內質網應激發生過度表達，細胞自噬的代償保護機制被打破，細胞凋亡被激活，與此同時，大鼠痛閾值顯著下降。研究證實[29]，外源性增加細胞自噬可在一定程度上緩解內質網應激水平，減少細胞凋亡，而自噬小體的形成是細胞自噬過程的關鍵環節，因此，本研究通過透射電子顯微鏡下觀察自噬小體及細胞超微結構的變化，進一步探討溫和灸大椎穴治療CSR大鼠的鎮痛效應機制及其與ERS介導的細胞自噬和凋亡的關系。

在本研究中，造模后大鼠痛閾值下降，經溫和灸干預后大鼠痛閾值上升，說明溫和灸具有良好的鎮痛效應，這與課題組前期研究相符[30]。王婷婷等[31]研究發現，艾灸可降低神經根受壓迫模型大鼠炎性刺激誘導的神經損傷，提高大鼠痛閾；或可通過釋放活性物質、鎮痛介質、增加血流代謝、改善局部微循環、降低神經傳導速度等途徑發揮鎮痛效應[32,33]。本研究結果表明，溫和灸干預后，CSR大鼠自噬小體增多，細胞結構較為完整，ERS標志性蛋白GRP78及其介導的凋亡因子CHOP、Caspase-12表達下降，大鼠痛閾值上升，提示溫和灸緩解CSR神經病理性疼痛的鎮痛機制可能與ERS介導的細胞自噬與凋亡有關。相關實驗研究發現，細胞自噬的增加可通過減少脊髓背角神經元凋亡從而有效的緩解神經病理性疼痛[34-36]。

3MA是一種特異性自噬抑制劑，通過抑制PI3K活性及自噬小體的形成，而抑制細胞的自噬過程[37]。本研究通過設置溫和灸+3MA組作為對照，發現與單純的溫和灸治療相比，應用3MA后，神經細胞的自噬小體減少，ERS應激水平及凋亡因子表達升高，大鼠痛閾降低，進一步驗證了內質網應激介導的細胞自噬和凋亡與CSR神經病理性疼痛密切相關，上調細胞自噬水平可保護受損神經。

綜上所述，溫和灸大椎穴能有效緩解CSR神經病理性疼痛，具有良好的鎮痛效應，其鎮痛機制可能與激活細胞自噬，緩解內質網應激水平，抑制細胞凋亡有關。