節律基因Per1在咽喉部鱗癌中的表達及與臨床病理和預后的相關研究*

王苗，金風，李媛媛，吳偉莉，龍金華，羅秀玲，龔修云，陳瀟瀟

550001 貴陽，貴州醫科大學臨床醫學院 腫瘤學教研室(王苗、金風、李媛媛)；550000 貴陽，貴州醫科大學附屬醫院·貴州省腫瘤醫院 頭頸腫瘤科(金風、李媛媛、吳偉莉、龍金華、羅秀玲、龔修云、陳瀟瀟)

頭頸部腫瘤是常見的惡性腫瘤之一，其發病率及死亡率分別占全球的第六位和第八位[1-2]，90%以上的病理類型為鱗癌，咽喉部鱗癌在頭頸部腫瘤中的發病呈逐年上升趨勢，盡管目前的診療技術不斷進步，但多數患者在確診時已屬晚期或伴晚期轉移，患者的預后較差[3]。Period-1(Per1)基因是機體內生理節奏調節的核心基因，在機體內參與調節機體生理節奏、調控細胞周期以及促進DNA損傷修復[4-5]等一系列的生理病理過程，并與腫瘤的發生、發展密切相關。研究表明，Per1基因廣泛參與食管癌[6]、膽管癌[7]、子宮內膜癌[8]、胰腺癌[9]、腎上腺癌[10]和口腔癌[11]等多種惡性腫瘤的增殖、遷移和侵襲過程，并發揮抑癌基因的作用，但相關研究多停留在分子機制層面，結合臨床數據相關的分析較少，本研究旨在探索節律基因Per1在咽喉部鱗癌中的表達及與臨床病理和預后的關系，以期為咽喉部鱗癌的生存預后尋找新的生物標記物提供依據。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2015年10月至2016年9月貴州省腫瘤醫院頭頸腫瘤科咽喉部鱗癌患者的術后病理標本15例及13例咽喉部活檢患者病理證實為非腫瘤的正常組織標本；同時收集了2013年1月至2017年3月60例經病理確診為咽喉部鱗癌患者的存檔蠟塊及其中的20例癌旁組織蠟塊，并收集對應患者的臨床病理資料，包括：年齡、性別、臨床分期(AJCC第七版)、是否手術、是否化療等。通過病歷閱讀和電話咨詢進行隨訪，根據《赫爾辛基宣言》倫理原則告知患者或其家屬切除的組織將用于病理學研究，所有操作規程均通過貴州省腫瘤醫院倫理委員會審批。

1.2 試劑

UNIQ-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒、PCR試劑盒、Per1及3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒購自賽默飛世爾科技有限公司；兔抗Per1多克隆抗體、GAPDH抗體購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的山羊抗兔二抗購自北京中衫金橋生物技術有限公司；DAB顯色試劑盒、蘇木精購自上海康朗生物科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷緩沖液(triethanolamine buffered saline,TBS)購自青島捷世康生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)均購自美國Gibco公司。

1.3 實時逆轉錄聚合酶鏈反應

1)使用UNIQ-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒，分別提取15例咽喉部鱗癌患者的術后病理標本及13例咽喉部活檢患者正常組織標本中的總RNA；2)按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明書將提取的兩組總RNA分別逆轉錄成cDNA；3)取逆轉錄產物cDNA為模板，利用PCR蛋白定量試劑盒以及Per1和內參照GAPDH的特異性引物進行實時定量PCR反應(表1)，所有反應均設置3個復孔，反應條件為95 ℃預變性10 min、95 ℃變性15 s、60 ℃退火延伸60 s，擴增40個循環。采用NANODROP2000實時定量PCR儀進行檢測，用2-△△Ct法計算兩組標本中Per1基因的mRNA表達量。

表1 實時熒光定量PCR各基因引物序列

1.4 免疫組化染色及判讀標準

將60例經病理確診為咽喉部鱗癌患者的存檔蠟塊及其中的20例癌旁組織蠟塊切片，常規脫蠟、水化和PBS沖洗后，加入枸櫞酸鹽修復液放入微波爐中行抗原修復2次，每次3 min，修復后冷卻至室溫，加入血清放入恒溫箱中封閉半小時，然后加入兔抗Per1一抗(1∶225稀釋)4 ℃過夜。TBS漂洗3次，每次5 min，加入HRP標記山羊抗兔二抗，37 ℃孵育30 min，TBS漂洗3次，每次5 min，DAB顯色液染色、蘇木精復染、梯度酒精脫水、封片，光鏡下觀察，每例切片隨機選取5個高倍鏡視野進行結果判定。Per1蛋白主要表達于細胞質，陽性染色為棕褐色、棕黃色或淡黃色。評分采用二級計分法：1)著色陽性細胞占視野總細胞百分率(陽性細胞數≤ 5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計2分，≥ 51%計3分)；2)按染色程度分級(無染色計為0分，淡黃色計1分，黃或棕黃色為2分，棕褐色為3分)。將兩者計分相乘，將≥ 2分和0～2分分別定義為陽性表達組和陰性表達組。病理診斷結果由兩名病理醫師確認。

1.5 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。Per1基因mRNA表達水平組間比較采用獨立樣本t檢驗。Per1基因蛋白表達與臨床病理特征的關系分析采用χ2檢驗或Fisher精確概率法，生存分析采用Kaplan-Meier法并行Log-rank檢驗，Cox風險比率回歸模型進行多變量生存分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 正常組織中Per1 mRNA和蛋白表達水平高于咽喉部鱗癌組織

15例咽喉部鱗癌組織和13例咽喉部正常組織的PCR檢測結果(圖1)顯示，與正常組織相比，咽喉部鱗癌組織中Per1mRNA表達水平相對較低，差異有統計學意義(P=0.001)。從表2可知，Per1蛋白在咽喉部鱗癌組織的陽性表達率為40%(24/60)，在癌旁組織中的陽性表達率為95%(19/20)，癌旁組織的Per1蛋白表達水平顯著高于癌組織(P< 0.001)。Per1蛋白在癌旁組織中主要表達于細胞核和細胞質，而在咽喉部鱗癌組織中主要表達于細胞質(圖2)。

圖1 Per1基因在咽喉部正常組織和咽喉部鱗癌組織中的mRNA表達水平

表2 咽喉部鱗癌組織與癌旁組織Per1蛋白表達水平

圖2 Per1蛋白在咽喉部鱗癌組織和癌旁組織中免疫組化染色(×200)

2.2 咽喉部鱗癌組織中Per1蛋白及mRNA表達水平與患者臨床病理特征的關系

60例咽喉部鱗癌組織蠟塊均有完整的臨床病理數據，其中男性49例，女性11例；患者中位年齡56歲；臨床分期I～II期9例，III～IV期51例；口咽癌1例，喉癌35例，下咽癌24例；患者均行放射治療，其中手術20例。表3顯示，60例咽喉部鱗癌組織Per1蛋白表達與患者性別、年齡、臨床分期、是否手術、是否化療無相關性(P>0.05)。但圖3顯示，15例咽喉部鱗癌患者Per1的mRNA表達水平與腫瘤分期相關，早期患者的Per1mRNA表達水平高于晚期患者(P=0.042)。

表3 60例咽喉部鱗癌組織中Per1蛋白表達與臨床病理特征的關系

圖3 早期和晚期咽喉部鱗癌患者Per1的mRNA表達水平

2.3 Per1蛋白表達與咽喉部鱗癌患者預后的關系

60例咽喉部鱗癌組織蠟塊均有完整的隨訪信息，中位隨訪時間42個月(17～61個月)，隨訪時間截止到2019年6月30日。統計學分析60例咽喉部鱗癌患者Per1蛋白陽性組和陰性組的生存率，由于部分患者存活時間不足5年，故計算3年總生存率(overall survival, OS)和無進展生存率(progression-free survival, PFS)，并用Kaplan-Meier生存曲線表示(圖4)。截至2019年6月30日，共有27例患者存活，33例患者死亡，其中31例死亡與腫瘤有關，1例死于突發性腦出血，1例死于心肌梗死。Per1蛋白陽性組和陰性組患者的3年OS分別為55.2%和24.3%，PFS分別為44.1%和20.7%，差異均有統計學意義(P=0.029,P=0.006)。Cox多因素回歸分析顯示，臨床分期及Per1蛋白表達是OS的獨立預后因素(P=0.010,P=0.026)(表4)。

圖4 Per1蛋白陽性組和陰性組咽喉部鱗癌患者的生存曲線

表4 咽喉部鱗癌患者影響總生存的預后多影響因素分析

3 討 論

咽喉部鱗癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，屬于高侵襲性實體腫瘤，目前，關于頭頸部腫瘤的治療仍以手術、化療、放療相結合的綜合治療為主，盡管隨著當前診療手段及技術的不斷進步，該類腫瘤的生存率較前有所改善，但晚期復發率及病死率仍較高[12]，因此，積極探索影響咽喉部鱗癌患者的發病及預后因素，有望改善咽喉部鱗癌患者的預后，為咽喉部鱗癌的檢測及治療提供新的思路。Per家族基因是機體生理節奏調節的核心基因，在機體內參與了細胞周期調控、DNA損傷修復、細胞凋亡等一系列生理病理過程[13]。相關研究發現，Per基因還廣泛參與了多種腫瘤的增殖、遷移和侵襲過程[6-11]。Han等[7]用qPCR法檢測了膽管癌細胞及非膽管癌細胞中Per1基因的表達情況，結果發現Per1在膽管癌細胞中的表達顯著降低；在細胞實驗中發現，Per1過表達細胞表現為細胞增殖能力顯著降低；進一步在動物體內研究發現，過表達Per1后，腫瘤的生長減少，增殖、血管生成和轉移減少。Orhan等[14]對16例結直腸癌手術患者的癌組織及配對的正常腸黏膜中的Per1表達水平進行了分析，結果發現，癌組織中的Per1表達水平顯著低于正常腸粘膜。我們的研究同樣證實了咽喉部鱗癌組織中Per1基因的表達水平較正常組織降低，并且我們發現，在局部晚期咽喉部鱗癌組織中Per1的表達水平顯著低于早期，這一點與之前的Per1基因在口腔鱗癌中的研究相似，該研究表明，與早期口腔鱗癌相比，局部進展期患者的Per1基因表達水平下調，且Per1基因表達的下調可顯著增加淋巴結轉移的風險[15]。這在另一個學者的研究中也得到了證實，該研究表明，在SCC15口腔鱗癌細胞中過表達Per1可顯著促進細胞的自噬和凋亡，同時抑制細胞的增殖和AKT/mTOR通路；而沉默Per1基因，則細胞自噬和凋亡減少，并以AKT/mTOR通路依賴的方式促進細胞增殖，從而促進口腔鱗癌的進展[16]。以上結果表明，Per1基因在咽喉部鱗癌中可能是抑癌基因，具有抑制腫瘤生成的作用。

本研究研究了Per1基因與咽喉部鱗癌患者臨床病理及預后的關系，完整隨訪收集了60例患者的臨床病理資料，采用免疫組化檢測了癌及癌旁組織中Per1蛋白的表達水平，結果表明，Per1蛋白表達與患者性別、年齡、臨床分期、是否手術、是否化療無相關性(P> 0.05)；Per1蛋白陽性表達組和陰性表達組患者的3年OS分別為55.2%和24.3%，3年PFS分別為44.1%和20.7%，差異均有統計學意義(P=0.029，P=0.006)；在多因素分析中顯示，臨床分期及Per1表達是影響患者OS的獨立預后危險因素。在此次生存分析中，我們研究的OS及PFS均低于以往大多數研究[17-19]，這可能與我們本次研究納入的樣本量較少，且患者多數以局部晚期患者為主，而且我們將未治療完成的患者也列入了分析，最終導致分析結果有所偏差所致。

綜上所述，咽喉部鱗癌是常見的惡性腫瘤，多數患者在確診時已屬晚期，臨床分期及Per1表達是影響其生存預后的獨立危險因素，所以早診斷、早治療顯得尤為重要，本研究顯示Per1在咽喉部鱗癌組織中表達較正常組織顯著降低，且Per1陽性表達組較陰性組表達生存預后更好，Per1可能成為臨床咽喉部鱗癌患者預后的一個預測指標，但這仍需要擴大樣本量去進一步驗證。

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doi:10.1016/j.drudis.2021.01.023．