雷公藤甲素-BSA完全抗原的合成與鑒定

重慶師范大學生命科學學院 蔡娜 付晨燕 于元蕾 王林玲

引言

雷公藤甲素（Triptolide）是從雷公藤的根、葉、花及果實中提取的一種環氧二萜內酯化合物，與雷公藤堿、雷公藤次堿等生物堿構成了雷公藤提取物的主要活性成分[1-2]。其性質為難溶于水，易溶于甲醇、無水乙醇、氯仿等[3]。具有顯著調節免疫、抗炎、抗生育及抗腫瘤等作用[4-6]，但雷公藤甲素自身水溶性差，治療窗窄，對消化、泌尿和血液系統等都有較大的毒副作用。因此在臨床上的應用受到限制[7-8]。

當天氣干旱、外界蜜源稀少時，蜜蜂更傾向于采集一些有毒植物的花蜜，多數以雷公藤植物或昆明山海棠的花蜜為主。雷公藤植物的主要活性成分是雷公藤二萜類、三萜類和生物堿類，其中毒性較強的是雷公藤二萜類，代表性物質為雷公藤甲素，蜜蜂采集了雷公藤植物或昆明山海棠的花蜜，會導致主要的二萜類毒性成分雷公藤甲素進入蜂蜜中。如果人們誤食此類蜂蜜，可引起中毒甚至死亡。因此建立雷公藤甲素的快速分析方法是非常必要的。

免疫分析是基于抗原和抗體之間的特異性反應，具有特異性高、靈敏度高、操作簡便快速等優點。由于雷公藤甲素是小分子化合物，不能直接用于抗體制備，而是需要和蛋白質連接形成完全抗原。本文主要研究雷公藤甲素和牛血清白蛋白（BSA）反應合成完全抗原。

1 材料與方法

1.1 材料

雷公藤甲素購自macklin，琥珀酸酐、碳二亞胺鹽酸鹽購自阿拉丁，牛血清白蛋白（BSA）購自J&Kchemical，鑰孔嘁血藍蛋白（KLH）購自Solarbio。

1.2 方法

1.2.1 完全免疫抗原的合成

10mgGTP和5mgcBSA溶解在500μlTEbuffer(pH8.2)中，在渦旋器上充分震蕩使其溶解，再取EDC·HCI160mg充分溶解于500μlTEbuffer（pH8.2）中。將GTP和15mgBSA的混合溶液邊震蕩邊逐滴加入EDC溶液，然后將磁力攪拌器溫度設置為37℃，將其溶液充分反應4個小時。用Sephadex柱分離偶聯產物和未結合的GTP小分子，透析純化，將1ml溶液在PBS中透析3d，于-20℃保存備用。

2 結果與分析

2.1 雷公藤甲素水溶性分子GTP的合成

TP在弱堿性條件下和琥珀酸酐進行酰化反應,是在目標物“-OH”處進行半抗原改造，改造后在該位點上增加“4個C（碳）”長度的間隔臂（該臂帶有-COOH），得到水溶性分子GTP，如圖1所示

圖1 GTP的結構合成

2.2 雷公藤甲素-BSA的合成與鑒定

GTP與BSA通過碳二亞胺法結合，GTP半抗原含有一個活性羧基，該羧基通過典型的EDC將載體蛋白進行偶聯。雷公藤甲素活化后與BSA偶聯后的終產物進行飛行時間質譜檢測如圖2所示,偶聯終產物的出峰時間比牛血清白蛋白出峰時間晚，如圖3所示說明偶聯終產物分子量比牛血清白蛋白分子量明顯,偶聯成功。

圖2 雷公藤甲素-BSA飛行時間質譜

圖3 BSA蛋白飛行時間質譜

3 討論

目前用于雷公藤甲素的檢測分析主要為儀器分析法，包括LC-MS/MS法、色譜等方法，具有靈敏度與精密度高的特點，但儀器設備昂貴且操作復雜。近年發展起來的免疫檢測法則克服了這些缺點，且操作簡便、高效、靈敏度高、特異性強。半抗原的設計、修飾（如何合成端基為功能基團且具有一定長度的連接臂）和人工抗原的制備（將半抗原修飾物與載體偶聯）是制備小分子化合物抗體的前提，是建立相應免疫分析方法的必要環節。本試驗采用已報道的雷公藤甲素完全抗原的制備方法，利用EDC法將GTP和牛血清白蛋白偶聯，用飛行時間質譜檢測顯示偶聯成功，從而為發展雷公藤甲素的免疫檢測方法做了基礎研究。