HPLC-DAD法同時測定舞陽貝母中9種核苷類成分的含量

李 珊，王曉燕，黃 霞，張紅偉*，劉 菊，趙一擎，茹慶國

(1.河南省食品藥品檢驗所，國家藥品監督管理局中藥材及飲片質量控制重點實驗室，鄭州 450018；2.鄭州市中醫院，鄭州 450007)

貝母為百合科貝母屬多種植物的鱗莖，是常用中藥之一，始載于《神農本草經》：“味辛，平。主傷寒煩熱；淋瀝邪氣；疝瘕；喉痹；乳難；金創風痙。”[1]。百合科(Liliaceae)貝母屬(FritillariaL.)植物的多數種類可供藥用，廣泛分布于北歐、北美洲及亞洲溫帶地域。我國貝母屬植物資源豐富，約有50個種類、19個變種，主要分布于浙江、四川、新疆、甘肅、湖北和安徽等省[2]。《中國藥典》2015年版一部中收載了川貝母、浙貝母、平貝母、湖北貝母和伊貝母等藥用貝母，全國各地用作貝母的原植物種類繁多，川貝母野生資源日漸枯竭，各地均有替代品[3]。現代藥理研究表明，貝母具有抑菌[4]、鎮咳[5-8]、平喘[9-12]和抗腫瘤[13-17]等作用。

舞陽貝母為百合科植物舞陽貝母FritillariawuyangensisZ.Y.Gao的干燥鱗莖或鱗葉，于1983年在河南省野生經濟植物資源考察中被發現，現已收入《河南省中藥材標準》，中藥材名為“貝母”。舞陽貝母主要分布在河南省舞鋼市、駐馬店市、南陽市和信陽市等地，為河南省特有的藥材資源，生于海拔230～700 m的山坡草叢或疏林草地，舞鋼市為其分布中心，現已人工栽培，療效確切，有較長的栽培和使用歷史[18]。但是，舞陽貝母的基礎研究相對薄弱，特別是對其化學成分的研究較少。貝母的水溶性活性成分主要為核苷類，現有研究多針對其核苷類成分進行含量測定[19-29]。核苷類物質是生物機體細胞維持生命活動的基本組成成分，具有多種生物活性[30]，可作為舞陽貝母的質量評價指標。本文建立能同時測定舞陽貝母中9種核苷類成分的高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)法，為舞陽貝母的進一步開發利用和質量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1儀器 Agilent1260型高效液相色譜儀，Agilent DEAA311731型(二極管陣列檢測器)，XPE205型萬分之一電子天平(瑞士梅特勒托利多公司)；KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Mili-Q Advantage A 10型超純水系統(美國Millipore公司)。

1.2試藥 甲醇為色譜純(德國默克股份兩合公司)；超純水，自制。舞陽貝母樣品經河南省食品藥品檢驗所雷留成主任藥師鑒定為百合科植物舞陽貝母FritillariawuyangensisZ.Y.Gao的干燥鱗莖或鱗葉。尿嘧啶(批號100469-201302，質量分數為99.6%)，次黃嘌呤(批號140661-200402，質量分數為99.0%)，尿苷(批號887-200202，質量分數為100.0%)，腺嘌呤(批號110886-200001，質量分數為100.0%)，鳥苷(批號111977-201501，質量分數為93.6%)，腺苷對照品(批號110879-200202，質量分數為100.0%)，均購自中國食品藥品檢定研究院。胞苷(批號TI180107-17，質量分數為98.0%)，胸苷 (批號ML190825-06，質量分數為98.0%)，2′-脫氧腺苷對照品(批號AL181124-13，質量分數為98.0%)，均購自上海源葉生物科技有限公司。9批舞陽貝母樣品信息見表1。

表1 舞陽貝母的樣品信息

2 方法與結果

2.1色譜條件 色譜柱為YMC-Triart C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相：甲醇(A)-水(B)，梯度洗脫(0～10 min，1%A～5%A；10～15 min，5%A～15%A；15～20 min，15%A～20%A；20～40 min，20%A～60%A)。柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：260 nm；進樣量：10 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液 精密稱取9種成分對照品各適量，加水溶解并定容至刻度，制成質量濃度分別為118.325、101.528、103.356、101.520、102.400、91.653、109.760、111.520、119.717 μg·mL-1的混合對照品溶液，于4 ℃冰箱內保存，備用。

2.2.2供試品溶液 精密稱取樣品粉末1.5 g，過3號篩，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加水10 mL，搖勻，稱定質量，室溫下超聲提取60 min(功率300 W，頻率50 kHz)，取出放冷至室溫，補足減失的質量，搖勻，倒入離心管中，以8 000 r·min-1離心5 min，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3系統適用性實驗 按照2.1項下色譜條件進樣，供試品中各相鄰色譜峰之間分離度除8號峰為1.4外，其余色譜峰分離度均大于1.5，理論塔板數均大于10 000，分離度良好，色譜圖見圖 1。

圖1 HPLC圖

2.4線性關系考察 精密吸取2.2.1項下制備的混合對照品溶液0.1、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0、20.0 mL，分別置于7個20 mL量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，搖勻，制成系列質量濃度的混合對照品溶液，按照2.1項下色譜條件進樣分析，記錄其色譜圖，以峰面積為縱坐標(y)、對照品質量濃度為橫坐標(x)進行線性回歸，建立回歸方程，結果見表2。

表2 9種核苷類成分的線性方程和線性范圍

2.5精密度實驗 取2.2.1項下制備的混合對照品溶液，按照2.1項下色譜條件連續進樣6次，記錄9種成分的峰面積，計算得到其RSD值分別為1.23%、1.05%、0.85%、0.34%、0.67%、0.29%、0.34%、0.48%、0.98%，表明儀器精密度良好。

2.6重復性實驗 精密稱取樣品(批號2019050802)粉末6份，每份1.5 g，按照2.2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，按照2.1項下色譜條件測定9種核苷類成分的含量，結果9種成分的RSD值分別為1.57%、1.86%、2.11%、0.98%、1.84%、1.49%、1.95%、1.36%、1.77%，表明本方法重復性良好。

2.7穩定性實驗 取2.2.2項下制備的供試品溶液(批號2019050802)，分別于0、2、4、8、12、24、36 h進樣測定，結果9種成分峰面積RSD值分別為0.91%、0.68%、0.87%、0.77%、0.94%、0.67%、0.75%、0.96%、0.72%，表明供試品溶液在36 h內穩定性良好。

2.8回收率實驗 精密稱取9種對照品各適量，分別加水溶解并定容至刻度，制成質量濃度分別為49.10、10.82、9.18、541.83、29.18、420.36、200.12、301.17、130.18 μg·mL-1的單一對照品溶液，備用。精密稱取含量已知的樣品(批號2019050802)共6份，每份0.75 g，分別精密加入上述單一對照品溶液各1 mL，加水至10 mL，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，測定含量，并計算回收率及RSD值，結果見表3。

表3 回收率實驗結果 (n=6)

2.9樣品含量測定 按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進樣測定，結果見表4。

表4 含量測定結果 (n=3)

3 討論

3.1提取條件的選擇 核苷類物質極性較大，在有機溶劑中溶解性差，在供試品制備時考察了以下因素：不同提取溶劑(純水以及體積分數分別為10%、20%、30%、40%、50%的甲醇)，不同溶劑用量(10、20、30 mL)，不同提取方法(超聲和回流)，不同提取時間(30、60、90 min)，發現10 mL純水超聲處理60 min的結果與加熱回流結果基本一致，提取率最高，且操作簡便、重復性好，故選擇加水10 mL超聲處理60 min的方法制備供試品溶液。

3.2色譜條件的優化 本文比較了5種不同色譜柱：YMC-Triart C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Waters-Symmetrm C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agela-Venusil XBP C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、JADE-PAKRS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，分別用甲醇和乙腈作為流動相，在不同的梯度洗脫條件下進樣，也比較了不同進樣量(5、10、15 μL)，不同流速(0.5、0.8、1.0 mL·min-1)，不同柱溫(25、30、35 ℃)，最終根據色譜圖基線、出峰數量、理論塔板數及分離度確定了2.1項下的色譜條件。

3.3檢測波長的選擇 采用DAD檢測器在200～400 nm波長范圍內對對照品及樣品進行掃描，綜合考慮不同波長下色譜峰的數量、紫外吸收、分離度和峰面積大小，最終選用260 nm作為最佳檢測波長。

3.4測定結果分析 由表4測定結果可知，不同批次的舞陽貝母樣品中9種核苷類成分含量差異較大，其中各批次中次黃嘌呤的含量普遍較低，鳥苷含量普遍較高。另外，本文采用的9批舞陽貝母樣品是由3種不同產地加工方法加工而成，分別是硫磺熏蒸、傳統炕制和烘箱烘干，由測定結果中9種核苷類成分的總含量可知，烘箱烘干的樣品含量最高(1 876.33～2 257.12 μg·g-1)，其次是傳統炕制(1 390.18～1 578.36 μg·g-1)，硫磺熏蒸的樣品含量最低(1 007.22 μg·g-1)，可見不同產地加工方法對9種核苷類成分總含量影響較大，烘箱烘干損失較小，而硫磺熏蒸損失較大。舞陽貝母樣品(批號2019080704)產地加工方法為硫磺熏蒸，9種核苷類成分總含量最低，且次黃嘌呤未檢出，有文獻報道顯示，硫磺熏蒸不僅可使中藥材及飲片殘留大量的二氧化硫，還伴有復雜的化學反應，會導致多種有效成分的化學結構和含量發生改變[31-32]，由此推測，硫磺熏蒸處理可能導致舞陽貝母樣品中次黃嘌呤含量普遍較低，樣品(批號2019080704)各成分含量普遍下降、9種核苷類成分總含量下降且次黃嘌呤未檢出。硫磺熏蒸對中藥核苷類成分的影響及其作用機制有待進一步研究。

目前，對舞陽貝母化學成分的基礎研究仍然很少，作為河南特色藥材，其在民間傳統用法是水煎劑，探討舞陽貝母的水溶性核苷類成分，對考察其質量，保證其臨床用藥的穩定性和有效性具有重要意義。本文首次建立了舞陽貝母藥材中9種核苷類水溶性成分的含量測定方法，使其水提取物中9種核苷類成分得到很好的分離，且精密度、重復性、穩定性均較好，為舞陽貝母的進一步開發利用提供科學依據。