三七皂苷R1對腦動脈硬化大鼠血管內皮細胞的影響

孫懷艷，楊曉丹，張夢翔，程耀堂

(1.安徽中醫藥大學第二附屬醫院藥劑科，合肥 230061；2.安徽中醫藥大學第三附屬醫院藥劑科，合肥 230061)

腦動脈硬化(CEA)是由于腦血流量減少發生的彌漫性動脈硬化，常發于中老年人，主要表現為神經衰弱、頸動脈粥樣硬化(AS)和眼底動脈硬化[1]。臨床主要采用降血脂藥物、擴張血管藥物、介入治療和對癥治療等治療CEA，但仍存在部分患者治療效果并不理想[2]。研究顯示[3]，CEA的發病機制可能與血管內皮損傷、脂質代謝障礙和高血壓等密切相關。三七皂苷R1(NR1)是從三七的根及根莖中提取的有效活性成分，具有止血定痛、活血化瘀的功效[4]以及抗炎、抗氧化、降血脂、降血壓等藥理學作用，可抑制AS的形成[5]。本研究探索了NR1對CEA大鼠腦組織損傷和血管內皮細胞(VEC)功能的影響及可能的機制，以期指導臨床治療CEA。

1 儀器與材料

1.1儀器 HX-Ⅱ型小動物血壓測量計，北京明信通生物科技有限公司；7600型全自動生化分析儀，日本HITACHI公司。

1.2試藥 三七皂苷R1(NR1)對照品，上海源葉生物科技有限公司；辛伐他汀(批號A19042301)，浙江京新藥業有限公司；內皮素-1(ET-1)檢測試劑盒，上海晶抗生物工程有限公司；一氧化氮(NO)檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔二抗，丹麥DAKO公司；兔抗鼠P-p38MAPK、p38MAPK、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和內皮型一氧化氮合酶(eNOS)抗體，均購自美國Santa Cruz公司。

1.3動物 雄性SPF級SD大鼠65只，體質量為(200±20) g，由安徽實驗動物中心提供，飼養于安徽中醫藥大學動物中心實驗室，室溫控制在25 ℃，所有大鼠均自由飲食飲水。

2 方法

2.1造模及給藥 所有大鼠預飼養1周后，隨機選取10只作為對照組，剩余55只大鼠采用雙腎雙夾法復制腎性高血壓CEA模型[6]，先行雙側腎主動脈狹窄手術復制腎性高血壓模型，術后1周給予高脂乳劑10 mL·kg-1，每日1次，連續灌胃14周，制備CEA模型，造模后大鼠出現血壓、血脂升高，且腦中動脈出現動脈硬化斑塊為造模成功，共50只大鼠造模成功；對照組只行雙側腎動脈分離術，飼喂常規飼料。將造模成功的大鼠隨機分為模型組、NR1高、中、低劑量組和辛伐他汀組，各10只。造模后NR1高、中、低劑量組分別灌胃NR1 100、50、25 mg·kg-1·d-1，每日1次；辛伐他汀組灌胃辛伐他汀2.5 mg·kg-1·d-1，連續給藥4周；模型組和對照組大鼠均灌胃等體積生理鹽水。

2.2各組大鼠血清相關指標的檢測 治療后，采用小動物血壓測量儀通過套尾法測定收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)和平均動脈壓(MAP)。分離腹主動脈血液，以3 500 r·min-1離心10 min，采用生化分析儀檢測血清膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)及低密度脂蛋白(LDL-C)的水平。

2.3HE染色觀察腦中動脈組織的病理變化 處死大鼠，迅速分離大鼠腦中動脈，用生理鹽水沖洗后，加入質量濃度為40 g·L-1的多聚甲醛進行固定，常規脫水、透明、包埋、切片、HE染色，在光學顯微鏡下觀察大鼠腦組織的病理變化，每張切片隨機取5個視野拍照。

2.4腦組織NO和ET-1水平檢測 取大鼠腦皮質及海馬組織，勻漿，參考試劑盒說明書采用硝酸還原酶法測定腦組織中NO水平，參考試劑盒說明書采用放射免疫直接測定法檢測腦組織中ET-1水平。

2.5Western Blot法測定腦組織中p38MAPK信號通路蛋白的表達 取大鼠腦皮質及海馬組織，勻漿，加入1 mL細胞裂解液，以12 000 r·min-1離心5 min，取上清液，置于-20 ℃冰箱中保存，采用二喹啉甲酸試劑盒進行蛋白定量，取50 μg提取的總蛋白樣品經SDS-PAGE凝膠電泳，采用濕轉法轉膜至硝酸纖維素膜，加質量濃度為50 g·L-1的脫脂牛奶封閉2 h，采用洗膜緩沖液(TBST)洗膜30 min，加入一抗p38MAPK、P-p38MAPK、eNOS、iNOS(1∶500)，以β-actin(1∶500)為內參，于4 ℃下孵育過夜，TBST洗膜30 min，并加HRP標記的二抗(1∶1 000)，37 ℃下孵育2 h，采用電化學發光顯影，采用Image J圖像分析系統分析蛋白相對表達量。

3 結果

3.1NR1對CEA大鼠腦中動脈損傷的影響 見圖1。由圖1可知，對照組大鼠腦中動脈組織細胞排列整齊，結構完整，未見明顯病變；模型組和NR1低劑量組大鼠腦中動脈壁明顯增厚，內皮細胞向管腔內突出，中層平滑肌細胞增生；NR1中、高劑量組和辛伐他汀組大鼠腦中動脈病理變化明顯減輕，且隨著劑量的增加，病變呈減輕趨勢。

圖1 各組大鼠主動脈的病理變化(HE，×200)

3.2NR1對CEA大鼠血壓的影響 見表1。由表1可知，模型組大鼠SBP、DBP和MAP水平明顯高于對照組(P<0.05)；NR1中、高劑量組和辛伐他汀組大鼠SBP、DBP和MAP水平明顯低于模型組(P<0.05)，且隨著NR1劑量的增加，各指標水平變化愈加明顯(P<0.05)。

表1 NR1對CEA大鼠血壓的影響

3.3NR1對CEA大鼠血脂的影響 見表2。由表2可知，與對照組比較，模型組大鼠TG、TC和LDL-C水平均明顯升高(P<0.05)，HDL-C水平明顯下降(P<0.05)；與模型組比較，NR1中、高劑量組和辛伐他汀組大鼠TG、TC和LDL-C水平明顯降低(P<0.05)，HDL-C水平明顯升高(P<0.05)，且隨著NR1劑量的增加，各指標水平變化愈加明顯(P<0.05)。

表2 NR1對CEA大鼠血脂的影響

3.4NR1對CEA大鼠腦組織NO和ET-1水平的影響 見表3。由表3可知，模型組大鼠腦組織NO和ET-1水平明顯高于對照組(P<0.05)；NR1中、高劑量組和辛伐他汀組大鼠腦組織ET-1水平明顯低于模型組(P<0.05)，且隨著NR1劑量的增加，各指標水平變化愈加明顯(P<0.05)。

表3 NR1對CEA大鼠NO和ET-1水平的影響

3.5NR1對CEA大鼠p38MAPK信號通路的影響 見圖2和表4。

圖2 NR1對CEA大鼠p38MAPK信號通路的影響

由圖2和表4可知，模型組和NR1中、高劑量組組大鼠腦組織P-p38MAPK/p38MAPK和iNOS的蛋白表達明顯高于對照組(P<0.05)，eNOS的蛋白表達明顯低于對照組(P<0.05)；NR1中、高劑量組和辛伐他汀組P-p38MAPK/p38MAPK和iNOS的蛋白表達明顯低于模型組(P<0.05)，eNOS的蛋白表達明顯高于模型組(P<0.05)，且隨著NR1劑量的增加，各指標變化愈加明顯(P<0.05)。

表4 NR1對CEA大鼠p38MAPK信號通路的影響

4 討論

CEA以腦AS為主，隨著病情的發展，可引起缺血性腦血管病，影響患者預后。CEA的發病機制復雜，與進行性脂質沉積、高血壓和VEC損傷等有關[7]。研究顯示[8]，高血壓及高血脂是CEA形成的主要危險因素，長期的高血壓和高血脂狀態可影響VEC功能，誘導動脈內膜增厚，引起腦血管管腔狹窄阻塞，影響腦局部組織血流量減少，引起腦組織缺血缺氧壞死，臨床常采用高血壓聯合高血脂法制備大鼠CEA模型。辛伐他汀是目前常用的降脂藥，可有效延緩CEA的形成[9]。NR1是從中藥三七中提取的有效活性成分，具有降血壓、調脂和抗氧化等多種作用，可延緩AS形成，但其具體作用機制尚不明確[10]。因此，本研究探討了NR1對CEA大鼠腦動脈組織損傷的作用及機制，以期指導臨床治療。

本研究中，CEA大鼠腦中動脈存在明顯損傷，動脈壁明顯增厚，經NR1干預后，可明顯減輕CEA大鼠腦中動脈組織的病理變化，降低腦中動脈壁厚度，抑制血管平滑肌增殖，還可降低血壓，降低TG、TC和LDL-C水平，升高HDL-C水平，且隨著濃度升高，各指標差異變化更顯著，提示NR1可能呈濃度依賴性地改善AS大鼠的血壓和血脂水平，抑制血管平滑肌增殖。Yao L等[11]研究顯示，長期高血壓可使動脈管壁增厚，形成硬化斑塊。高血脂是影響CEA發生和進展的主要危險因素，血脂中的主要成分是TG和TC，LDL-C是運輸內源性TC到肝外組織的主要載體，HDL-C可將肝外組織中的TC轉運至肝臟組織中，進行代謝，從而降低機體的血脂水平[12]。Fernández-Friera L等[13]研究顯示，血脂水平與VEC損傷密切相關，LDL-C進入血管內皮細胞后可誘導細胞氧化，促進活性氧(ROS)的產生，形成氧化修飾低密度脂蛋白(ox-LDL-C)，加重VEC氧化損傷，促進CEA的形成，提示NR1可能通過機體的血壓和血脂水平，減輕血管VEC的氧化應激損傷。

本研究中，NR1干預可降低CEA大鼠腦組織ET-1和NO水平，且隨著濃度升高，各指標差異變化更顯著。ET-1和NO是一組由VEC分泌的細胞因子，可共同作用調節血管的收縮功能，其中NO可通過多種途徑抑制ET-1的分泌，擴張血管，抑制血管平滑肌細胞的增殖，還可清除機體過多的氧自由基，減輕細胞氧化應激損傷[14]。ET-1是一種強力的血管收縮因子，可通過抑制eNOS的表達而抑制NO的合成，促進血管平滑肌增殖，誘導動脈血管壁增厚，促進CEA的形成[15]。NO主要由一氧化氮合成酶(NOS)合成，包括神經元型NOS、iNOS和eNOS。研究顯示，eNOS可合成并分泌少量的NO，從而抑制收縮因子ET-1的分泌，抑制血管平滑肌增殖，活化的iNOS可合成并分泌大量的NO和過氧化物，激活組織細胞的氧化應激反應，誘導VEC的氧化應激損傷[16]。李春曉等[17]研究發現，NO和ET-1水平異常升高可反映腦組織的VEC功能，誘導組織損傷，提示NR1可通過調節腦組織NO和ET-1水平變化，保護VEC功能。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路包括3條途徑，細胞外調節蛋白激酶1/2(ERK1/2)通路、c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路及p38MAPK通路。近年來研究顯示[18]，p38MAPK信號通路被磷酸化激活后，可調節下游iNOS和eNOS的表達，參與調節VEC功能。本研究中，NR1干預可降低CEA大鼠腦組織p38的磷酸化，促進eNOS的蛋白表達，抑制iNOS的蛋白表達。孫慧琳等[19]研究顯示，胰高血糖素樣肽1可抑制p38MAPK的磷酸化，促進eNOS的蛋白表達，減輕VEC的氧化損傷，延緩糖尿病大鼠AS的形成。錢風華等[20]研究顯示，p38MAPK抑制劑可抑制iNOS的蛋白表達，改善膿毒癥大鼠的心肌損傷，提示NR1可能通過抑制p38MAPK的磷酸化，上調eNOS的蛋白表達，下調iNOS的蛋白表達及NO和ET-1水平，改善VEC功能。

綜上所述，NR1可通過抑制CEA大鼠p38MAPK的磷酸化，調節eNOS、iNOS的蛋白表達及NO、ET-1水平，降低血壓和血脂水平，改善VEC功能，延緩CEA發展。但本研究尚處于探索階段，其具體機制還需進一步驗證。