真菌次級代謝產(chǎn)物可皆霉素的抗炎活性研究

鞏 芳，郭繼倩，尹震花，張娟娟，郭慶豐，陳 林*

(1.河南醫(yī)學高等專科學校附屬醫(yī)院藥劑科，鄭州 451191；2.鄭州市天然產(chǎn)物合成生物學重點實驗室，河南省小分子新藥研發(fā)國際聯(lián)合實驗室，黃河科技學院，鄭州 450063)

天然產(chǎn)物是尋找天然活性成分的重要資源之一。真菌因其資源豐富、代謝產(chǎn)物結構新穎等特點，越來越受到學者的關注[1-2]。可皆霉素為苯醌類化合物，分子式為C32H30N2O4，相對分子質量為506.22，結構式見圖1，是一種從球殼科毛殼屬狹旋毛殼菌種(來自美國模式培養(yǎng)物集存庫，菌種編號：ATCC No.56725)中分離得到的一種天然次生代謝產(chǎn)物，質量分數(shù)高達98.76%。研究表明，目前可皆霉素僅在毛殼屬(Chaetomiumglobosum，C.cochliodes)中分離得到，具有抗菌[3-4]、抗癌[5]和抗凝血[6]等作用。目前未見對其抗炎作用的研究。

圖1 可皆霉素的結構式

一氧化氮(NO)是炎癥和炎癥性疾病的化學指標[7]，不但在血管反應中起主要作用，而且還參與免疫系統(tǒng)反應和血小板的調節(jié)反應，作為細胞因子在炎癥反應中扮演了重要角色。因此，抑制NO在體內的分泌可有效抑制炎癥反應。本文采用CCK-8法測定可皆霉素對RAW264.7細胞NO分泌量的影響，評價可皆霉素的抗炎活性，為其今后的研發(fā)提供參考。

1 儀器與材料

1.1儀器 SW-CJ-2FD型超凈工作臺(浙江蘇凈凈化設備有限公司)；GPJ9-TS100-F型倒置顯微鏡(日本尼康公司)；3599型細胞培養(yǎng)板(康寧公司)；BB15型二氧化碳(CO2)細胞培養(yǎng)箱，1510型全自動酶標儀，均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；TGL-16G型離心機(常州市金壇友聯(lián)儀器研究所)；AR1140型電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)。

1.2試藥 可皆霉素(質量分數(shù)為98%)，黃河科技學院納米功能材料研究所；RPMI-1640培養(yǎng)基(北京華工科創(chuàng)生物公司)；青鏈霉素混合液(雙抗，Solarbio公司)；內毒素脂多糖，二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司)；一氧化氮(NO)試劑盒，CCK-8試劑盒(南京建成生物工程研究所)；地塞米松片(南國藥業(yè)有限公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，實驗室自制)；乙醇(體積分數(shù)為75%，山東安捷高科消毒科技有限公司)；澳洲胎牛血清(FBS，Gibco公司)。

1.3材料 小鼠單核巨噬細胞RAW264.7，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

2 實驗方法

2.1溶液的制備

2.1.1細胞培養(yǎng)液 將胎牛血清(0.1 mL·mL-1)和青鏈霉素混合液(青霉素為100 u·mL-1，鏈霉素為100 μg·mL-1)加到RPMI-1640培養(yǎng)基中，混勻，保存在4 ℃冰箱中。

2.1.2細胞凍存液 將2.1.1項下制備的細胞培養(yǎng)液、胎牛血清和高壓滅菌的DMSO以7∶2∶1混勻，密封，4 ℃保存。

2.1.3脂多糖(LPS)溶液 用DMSO溶解LPS，再用2.1.1項下制備的細胞培養(yǎng)液稀釋，配成質量濃度為100 μg·mL-1的溶液。將上述溶液用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，保存在4 ℃冰箱中，實驗前用2.1.1項下制備的細胞培養(yǎng)液稀釋成所需的質量濃度，用微孔濾膜過濾后使用。

2.1.4對照品溶液 將可皆霉素、地塞米松片和LPS分別用DMSO溶解，再用2.1.1項下制備的細胞培養(yǎng)液稀釋，將可皆霉素及地塞米松片配成質量濃度為50 μg·mL-1的母液，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，4 ℃保存。實驗前用2.1.1項下制備的細胞培養(yǎng)液稀釋成所需的質量濃度，用微孔濾膜過濾后使用。在實驗中DMSO的質量濃度均小于1 μg·mL-1，以保證對實驗結果無明顯影響。

2.2細胞培養(yǎng)

2.2.1細胞培養(yǎng)與傳代 將細胞置于細胞培養(yǎng)皿中，加入2.1.1項下制備的細胞培養(yǎng)液10 mL，在 37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育，隔天換液1次。當細胞長滿培養(yǎng)皿底的80%以上時對細胞進行傳代；用移液槍吸棄培養(yǎng)液，用PBS 3 mL沖洗2～3遍，再加入細胞培養(yǎng)液3 mL，用無菌細胞刮刀刮取，置于倒置顯微鏡下觀察。用移液槍吹打使細胞混勻，按照1傳3接種到新的培養(yǎng)皿中。

2.2.2細胞凍存 置于倒置顯微鏡下觀察，若細胞處于對數(shù)期且狀態(tài)良好，可以對其進行凍存。離心收集細胞，加入2.1.2項下制備的細胞凍存液1 mL，吹打成懸浮細胞后吸入凍存管中。于4 ℃冰箱中放置30 min，-20 ℃冰箱中放置30 min，-80 ℃冰箱中放置過夜，最后放入液氮罐中保存。

2.2.3細胞復蘇 從液氮罐中取出細胞凍存管后，放入37 ℃的水浴中快速振搖使其迅速溶解，移至離心管中，以1 000 r·min-1離心5 min，將細胞轉入細胞培養(yǎng)皿中，加入2.1.1項下制備的細胞培養(yǎng)液10 mL，并用移液槍吹打混勻，置于CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁后，更換培養(yǎng)液。

2.2.4細胞計數(shù) 取出細胞計數(shù)板，把細胞計數(shù)板和蓋玻片用酒精棉球擦拭干凈，晾干，用鑷子將蓋玻片蓋于計數(shù)板上。用無菌細胞刮刀使細胞脫壁，離心后加入新的細胞培養(yǎng)液5 mL，吹打使細胞混勻，取出200 μL稀釋成細胞懸液1 mL，吹打均勻后，吸取10 μL，沿著蓋玻片邊緣滴加，使其充滿細胞計數(shù)板和蓋玻片之間的空隙，不能有氣泡；置于倒置顯微鏡下，計數(shù)4個大格內的細胞總數(shù)(若細胞壓線，只計壓上線和左線者，細胞團按單個細胞計數(shù))。按照公式計算：細胞總數(shù)(個·mL-1)=(4大格細胞總數(shù)÷4)×104×稀釋倍數(shù)。

2.3LPS刺激RAW264.7細胞構建炎癥細胞模型并確定最佳劑量 取處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，以105個·mL-1的單細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板(每孔100 μL)，將培養(yǎng)板置于37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后用LPS進行誘導。實驗分為饑餓組和無饑餓組，饑餓組在加LPS之前將舊的細胞培養(yǎng)液棄去換成無FBS的培養(yǎng)液。LPS的終質量濃度分別為0、0.01、0.10、1.00、10.00、100.00 μg·mL-1，各質量濃度設5個復孔，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后終止培養(yǎng)，按照NO試劑盒說明書操作，在550 nm 波長處測定吸光度值A，計算細胞的NO分泌量。以確定LPS 刺激的最佳質量濃度。

2.4可皆霉素和LPS對RAW 264.7細胞活力的影響 (1)取處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，以105個·mL-1的單細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板(每孔100 μL)，將培養(yǎng)板置于37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。(2)實驗分為空白組、正常對照組和藥物組。空白組：只加入2.1.1項下制備的細胞培養(yǎng)液；正常對照組：只加入細胞；藥物組：可皆霉素稀釋到不同質量濃度(5.00、12.50、25.00 μg·mL-1)，LPS稀釋至不同質量濃度(0.01、0.10、1.00、10.00、100.00 μg·mL-1)，每孔加入100 μL，各質量濃度設5個復孔。將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中孵育48 h。(3)每孔加入CCK-8試劑10 μL，然后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～4 h。(4)用酶標儀在450 nm 波長處測定其吸光度值A。細胞存活率=(A藥物組-A空白組)÷(A正常對照組-A空白組)×100%。

2.5可皆霉素對LPS刺激RAW264.7細胞分泌炎癥介質NO分泌量的影響 (1)取處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，以105個·mL-1的單細胞懸液接種于96 孔細胞培養(yǎng)板(每孔100 μL)，將培養(yǎng)板置于37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h。(2)實驗分為空白組、LPS模型組、可皆霉素組和地塞米松組。空白組只加入2.1.1項下制備的細胞培養(yǎng)液；LPS模型組加入含有1 μg·mL-1LPS的細胞培養(yǎng)液；可皆霉素組在LPS模型組的基礎上，將可皆霉素設置3個質量濃度梯度(5.00、12.50、25.00 μg·mL-1)；地塞米松組在LPS模型組的基礎上，將地塞米松片設置3個質量濃度梯度(5.00、12.50、25.00 μg·mL-1)。每孔加入100 μL，各質量濃度設3個復孔。將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中孵育，24 h后終止培養(yǎng)，按照NO試劑盒的說明書操作，在550 nm波長處測定吸光度值A，計算NO的分泌量。

3 實驗結果

3.1可皆霉素對RAW 264.7細胞存活率的影響 見表1和表2。

表1 不同質量濃度的LPS作用后的RAW 264.7細胞存活率

由表1可知，LPS質量濃度為0.01～100.00 μg·mL-1時，細胞存活率為97.14%±6.07%～139.08%±9.15%，表明在此質量濃度范圍內LPS無明顯細胞毒性作用。而且1.00 μg·mL-1LPS作用于RAW 264.7細胞48 h后，細胞活力增加到139.08%±9.15%，且細胞多由圓形變?yōu)樗笮蔚炔灰?guī)則形態(tài)，并出現(xiàn)細長偽足。由此可知，LPS刺激RAW 264.7細胞后，細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，說明RAW264.7 細胞受到1.00 μg·mL-1LPS 作用48 h后，活力增強。

由表2可見，當可皆霉素質量濃度為12.5 μg·mL-1及以上時，細胞存活率較低，細胞毒性較大，半數(shù)抑制質量濃度(IC50)為11.51 μg·mL-1。

表2 不同質量濃度的可皆霉素作用后的RAW 264.7細胞存活率

3.2LPS和可皆霉素對刺激RAW264.7細胞NO分泌量的影響 見表3和表4。由表3可知，不同質量濃度的LPS 對RAW264.7細胞NO分泌量具有促進作用，但饑餓條件較無饑餓條件下作用明顯，且作用強度與劑量有關。由此表明，LPS可促進RAW264.7細胞分泌NO，且LPS刺激RAW264.7細胞構建炎癥細胞模型的最佳方法和質量濃度為：饑餓處理，即在加LPS之前將舊的細胞培養(yǎng)液棄去換成無FBS的培養(yǎng)液，LPS質量濃度為1.00 μg·mL-1。

表3 不同質量濃度的LPS刺激RAW264.7細胞分泌NO的量

由表4可知，與空白組相比，LPS模型組RAW264.7細胞NO的分泌量明顯增加(P<0.01)。與LPS模型組相比，可皆霉素各劑量組和地塞米松各劑量組NO分泌量均明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。由分析抑制率可知，地塞米松對LPS 刺激 RAW264.7細胞分泌的炎癥介質NO抑制作用顯著，且呈劑量依賴性。可皆霉素對LPS 刺激RAW264.7細胞分泌的NO有抑制作用，但與地塞米松組相比抑制作用較弱，且無明顯劑量依賴性。在質量濃度為12.50 μg·mL-1時，可皆霉素對NO的抑制率達到96.88%，抑制作用顯著強于質量濃度為12.50 μg·mL-1的地塞米松片(91.71%)。

表4 不同質量濃度的可皆霉素作用后細胞的NO分泌量及抑制率

4 討論

炎癥是一種復雜的生理現(xiàn)象，是一種以感染、組織損傷、創(chuàng)傷或有害刺激為特征的積極反應[8]。然而過度的炎癥反應會對宿主細胞和組織造成災難性后果，引發(fā)各種自身免疫性疾病，包括動脈粥樣硬化、糖尿病、心血管疾病和癌癥[9-10]。利用LPS刺激巨噬細胞炎癥已被用來探索抗炎化合物[11-13]。本文采用LPS刺激RAW 264.7小鼠巨噬細胞作為炎癥細胞模型，研究可皆霉素對RAW264.7細胞NO分泌量的影響，評價可皆霉素的抗炎活性。

巨噬細胞經(jīng)LPS刺激后可產(chǎn)生大量的炎性因子，如NO、腫瘤壞死因子、白細胞介素等[14-15]。NO是機體內重要的信號分子，是由神經(jīng)型、內皮型和誘導型3種一氧化氮合成酶(NOS)催化生成，在機體循環(huán)、神經(jīng)、免疫系統(tǒng)及細胞凋亡等過程中都起著十分重要的作用[16-17]。研究表明，組織中的誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)在炎癥反應中被誘導產(chǎn)生，生成大量NO，促進炎癥反應發(fā)生，因此若樣品能夠降低炎性反應中NO的含量，即被認為具有抗炎作用[18-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，可皆霉素具有良好的NO分泌抑制活性，抑制率可達96.88%，抑制作用顯著強于地塞米松片。本實驗初步研究了可皆霉素的抗炎作用，為其進一步開發(fā)利用提供了參考。