黃芪多糖通過線粒體自噬抑制肝癌腫瘤細胞

張慧蓉，錢 敏，李 萌

(1.淄博岜山萬杰醫院檢驗科，淄博 255200；2.濟南市第一人民醫院檢驗科，濟南 250031;3.山東省立第三醫院檢驗科，濟南 250031)

黃芪多糖(APS)是從中草藥黃芪Astragalusmongholicus中分離得到的，常作為免疫增強劑用于臨床[1]。APS具有許多生物學作用，對糖尿病、腫瘤等疾病的防治具有重要應用價值，能有效調節肥胖大鼠血脂水平并改善胰島素抵抗，其機制可能是通過增加大鼠腓腸肌組織中的胰島素受體底物(IRS1)水平、降低胰島素受體底物(IRS1)307位絲氨酸磷酸化(Serine307)水平實現的[2]。APS可抑制胃癌、肝癌、宮頸癌和乳腺癌等惡性腫瘤細胞的增殖[1]，還可通過下調Janus激酶信號通路對肝癌細胞的侵襲和轉移產生抑制作用[3]。

自噬在生理和病理過程中起著廣泛作用，如饑餓適應[4]、胚胎發育[5]、細胞存活和死亡[6]以及腫瘤抑制[7]。文獻報道[5]，在代謝應激下，自噬既可抑制又可促進腫瘤的發展，一方面，自噬可通過清除受損線粒體，使腫瘤細胞存活，促進腫瘤的發展；另一方面，自噬還通過過度的自我消化和凋亡激活直接或間接誘導自噬細胞死亡，抑制腫瘤進展[5]。

在本研究中，使用肝癌細胞SMMC-7721評估APS能否抑制SMMC-7721增殖、能否刺激自噬以及是否涉及自噬。

1 材料

人肝癌細胞SMMC-7721，中國科學院細胞庫。APS 粉針劑(規格：250 mg·瓶-1)，天津賽諾制藥有限公司；RPMI 1640 培養基，胰蛋白酶,Thermo Fisher公司；胎牛血清，Hyclone 公司；溴化噻唑藍四氮唑(MTT)試劑盒，姬姆薩染液，二甲基亞砜(DMSO)，碘化丙錠(PI)，BCA 蛋白定量試劑盒，均購自上海碧云天生物公司；3-甲基腺嘌呤(3-MA)和巴佛洛霉素A1(Baf)，均購自Sigma-Aldrich公司。

2 方法

2.1細胞培養 將SMMC-7721細胞培養于含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，置于37 ℃恒溫箱(含體積分數為5%CO2)中保存。

2.2分組 APS低、中、高劑量組(質量濃度分別為0.75、1.50、3.00 mg·mL-1)以及對照組(只加生理鹽水)。

2.3平板克隆形成實驗檢測細胞的增殖 將細胞以3×102個·孔-1的密度接種于24 孔板中，培養24 h 后，分別加入APS，使其終質量濃度分別為0.75、1.50、3.00 mg·mL-1，對照組僅加生理鹽水。每組設3個平行孔，孔內液體終體積為500 μL。置于37 ℃的孵箱(體積分數5%CO2)中孵育10 d。加甲醇300 μL，室溫固定15 min，姬姆薩染液染色20 min，空氣中干燥后計數[8]。

2.4MTT 法檢測細胞存活率 將細胞以3×103個·孔-1的密度接種于96 孔板中，分別加入APS，使其終質量濃度為0.75、1.50、3.00 mg·mL-1，對照組僅為培養液。每組設3個平行孔，孔內液體終體積為200 μL。培養結束后，每孔加入20 μL 新配制的質量濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液，37 ℃孵育4 h，用DMSO溶解，應用酶標儀在570 nm波長處測定吸光度值A[9-10]。

2.5細胞周期檢測 收集細胞后，用體積分數為70%的冷乙醇固定過夜。用PBS沖洗2次，加50 μg·mL-1PI染液，4 ℃避光反應 30 min。用Beckman流式細胞儀收取細胞(每個樣品收集1×104個細胞)。

2.6Western Blot 處理結束后收集細胞，用RIPA裂解液裂解細胞，BCA法測定蛋白濃度。制備SDS-PAGE凝膠，電泳，轉膜。將PVDF膜置于50 g·L-1脫脂奶粉中封閉1 h后，加入相應一抗，4 ℃孵育過夜。第2天用TBST緩沖液室溫下沖洗后加入相應二抗，室溫孵育1 h。以β-actin作為參照。采用BIO-RAD 凝膠成像系統曝光采集圖片。最后使用NIH Image J 軟件進行定量分析[11-12]。

2.7統計學方法 所有統計均使用SPSS 16.0軟件包。統計學顯著性通過t檢驗確定。本研究中的所有測試都是雙側的，P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1APS抑制肝癌細胞平板克隆形成 結果表明，對照組以及APS低、中、高劑量組的SMMC-7721細胞克隆數分別為88.2±8.5、81.6±8.2、53.3±6.9、22.5±3.4。與對照組比較，APS可使SMMC-7721細胞克隆數減少，且其作用呈質量濃度依賴性，APS高劑量組對細胞增殖的抑制作用最明顯。以上結果提示APS可顯著抑制SMMC-7721細胞增殖。

3.2APS對SMMC-7721細胞增殖的抑制作用 見表1。由表1可知，培養72 h后，APS可明顯抑制SMMC-7721細胞增殖，其中APS高劑量組抑制作用最強，呈質量濃度依賴性。

表1 APS抑制SMMC-7721細胞增殖的作用

3.3APS對SMMC-7721細胞周期的影響 見表2。由表2可知，與對照組比較，APS可使SMMC-7721細胞S期細胞比例減少，而G0/G1期細胞比例增加，以上結果提示APS可顯著抑制SMMC-7721細胞增殖。

表2 APS對SMMC-7721細胞周期的影響 (n=6)

3.4APS對Beclin 1、微管相關輕鏈3B (LC3B)和p62等自噬相關蛋白表達的影響 見圖1和表3。結果表明，APS可顯著增加Beclin 1、LC3B和p62的蛋白表達，刺激線粒體自噬，且APS高劑量組抑制細胞增殖的作用更加明顯，因此選用APS高劑量組進行后續實驗。

圖1 Western Blot圖

表3 APS刺激LC3B、Beclin 1和p62等線粒體自噬相關蛋白表達的Western Blot統計結果

3.5自噬介導APS刺激SMMC-7721細胞凋亡 應用線粒體自噬抑制劑在不存在或存在3-MA和/或Baf的情況下，用不同質量濃度的APS預處理SMMC-7721細胞，檢測APS的抑制作用，見表4。由表4可知，3-MA和Baf均能部分抑制APS引起的細胞凋亡。

表4 線粒體自噬抑制劑阻斷APS刺激SMMC-7721細胞凋亡的作用 (n=5)

4 討論

本課題組對APS能否抑制肝癌細胞增殖、作用是否涉及線粒體自噬進行研究，結果發現，APS可顯著抑制SMMC-7721細胞的增殖，還可顯著刺激自噬，且其抑制作用可被線粒體自噬抑制劑抑制。以上結果表明，APS可通過線粒體自噬抑制SMMC-7721細胞。

肝癌在臨床上病情進展速度快、預后較差[3]。中藥提取物APS具有增強免疫的作用，安全性良好。Zhou L等[13]研究發現，APS可調節宿主機體免疫，其機制涉及Toll 樣受體 4(TLR4) 介導的MyD88信號通路的激活。此外，APS還可抑制肝癌細胞 H22 實體瘤的形成，且與阿霉素具有協同抗腫瘤的作用[14]。結果發現，APS可顯著抑制SMMC-7721細胞的增殖，其作用呈質量濃度依賴性。

自噬是特異性地降解細胞內老化蛋白質、細胞質和細胞器的過程，包括隔離、運輸到溶酶體、降解和降解產物的利用[15]，其特征是出現雙膜和多膜細胞質小泡，吞噬細胞質和細胞器，形成以微管相關蛋白輕鏈3(LC3)[16]為標志的自噬體。許多關鍵分子參與了這一生物過程，酵母自噬蛋白6(Atg6)又稱膜泡分揀蛋白30(Vps30)，是Beclin 1的哺乳動物同源物，研究表明，它可通過介導其他自噬蛋白在自噬前膜上的定位來促進自噬體形成，因此是一種重要的調節器[17]。線粒體自噬在腫瘤中也是重要的信號通路[18]。本研究結果表明，APS 可顯著抑制肝癌 SMMC-7721 細胞的增殖和活性，最佳質量濃度為3.00 mg·mL-1，且該質量濃度的APS可顯著刺激LC3B、Beclin 1和p62等自噬相關蛋白的表達。為了進一步證實APS是否通過激活自噬起到抑制腫瘤的作用，本課題組用自噬信號通路抑制劑3-MA和Baf預處理，結果發現，當自噬受到抑制后，APS的腫瘤抑制作用顯著減弱，因此其腫瘤抑制作用可能涉及自噬的激活。

綜上所述，本研究結果表明，APS可抑制肝癌細胞SMMC-7721 的增殖和活性，其作用機制由自噬介導。