沒食子酸在大鼠體內(nèi)的藥物動力學(xué)特征及生物利用度研究

朱鈺璞，張維敏，武 坤，王四旺，余 喆，李 驊*

(1.空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)員大隊，西安 710032；2.解放軍第518醫(yī)院藥劑科，西安 710043；3.空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系中藥與天然藥物學(xué)教研室，西安 710032；4.空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥物化學(xué)與藥物分析學(xué)教研室，西安 710032)

沒食子酸(3，4，5-三羥基苯甲酸，gallic acid，GA)又名五倍子酸，是一種天然多酚類化合物，廣泛存在于丹皮、赤芍、廣棗、費菜等活血化瘀中藥材中，亦富含于檸檬、石榴、葡萄以及綠茶、紅茶等預(yù)防心血管疾病的藥食中[1-3]，是眾多中成藥中的主要有效成分[4-6]。研究顯示，沒食子酸不僅具有顯著的抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化以及神經(jīng)保護和心臟保護活性[7-11]，且具有良好的安全性。急性毒性實驗表明，當(dāng)沒食子酸給藥劑量達到小鼠體內(nèi)給藥的最高限度時仍未觀察到小鼠有死亡或急性中毒的現(xiàn)象[12]。沒食子酸單體單劑量給藥后的藥物動力學(xué)行為已有相關(guān)文獻報道，如Shahrzad S等[13-14]通過高效液相色譜法(HPLC)考察了人單劑量口服沒食子酸單體后的藥物代謝動力學(xué)特性，王曉莉等[15]對大鼠單劑量灌胃沒食子酸后的體內(nèi)藥物動力學(xué)特征進行了初步探究。本實驗擬通過建立測定大鼠血漿中沒食子酸的HPLC法，研究大鼠單次灌胃不同劑量及靜脈注射沒食子酸后的藥物動力學(xué)特征和絕對生物利用度，為沒食子酸及其相關(guān)制劑的開發(fā)及臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與材料

1.1儀器 LC-2010A HT型高效液相色譜系統(tǒng)(日本Shimadzu公司)；ME235S型微量分析天平(德國Sartorius公司)；TDZ5-WS型臺式低速離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；Certrifuge 5417R臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。

1.2試藥 沒食子酸原料藥(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%，西安金綠生物工程技術(shù)有限公司，批號160903)；沒食子酸對照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%，中國食品藥品檢定研究院，批號11831-200803)；4-乙酰氨基酚(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號20141128)；甲醇為色譜純(美國Honeywell公司)；水為去離子水；聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP K30，巴斯夫新材料有限公司)；微晶纖維素(山東聊城阿華制藥股份有限公司)；交聯(lián)羧甲基纖維素鈉(明臺化工股份有限公司)；磷鎢酸鈉(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；十二烷基硫酸鈉(安徽山河藥用輔料股份有限公司)；0.45 μm聚偏四氟乙烯膜(杭州科百特過濾器材有限公司)。

1.3實驗動物 雄性SD大鼠，體質(zhì)量為320～350 g，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，合格證號：SCXK(軍)字第2012-0007號。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Woburn Bio-technologies Stamsil ODS-BP色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；流動相：甲醇-冰醋酸-水(5∶1.9∶93.1)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：272 nm；進樣量：20 μL。

2.2對照品溶液和藥液的配制 精密稱取沒食子酸對照品10 mg，置于10 mL棕色量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇(含體積分?jǐn)?shù)為1%的冰醋酸)使溶解，定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為1.00 mg·mL-1的對照品母液；將對照品母液按比例稀釋，制成沒食子酸系列對照品溶液(質(zhì)量濃度為0.05～20.00 μg·mL-1)，4 ℃冷藏待用。精密稱取4-乙酰氨基酚對照品10 mg，置于10 mL棕色量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇(含體積分?jǐn)?shù)為1%的冰醋酸)使溶解，定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為1.00 mg·mL-1的內(nèi)標(biāo)母液；將內(nèi)標(biāo)母液稀釋，制成4-乙酰氨基酚質(zhì)量濃度為40 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)供試溶液，4 ℃冷藏待測。精密稱取沒食子酸原料藥適量，分別用蒸餾水制成沒食子酸質(zhì)量濃度為10、5 mg·mL-1的藥液。

2.3血漿樣品的處理 精密吸取血漿200 μL，置于離心管中，加體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇(含體積分?jǐn)?shù)為1%的冰醋酸)100 μL，2.2項下制備的內(nèi)標(biāo)供試溶液(40 μg·mL-1)50 μL，1 mol·L-1鹽酸100 μL，乙酸乙酯1.5 mL，用渦旋振蕩器充分振搖5 min，以4 000 r·min-1離心15 min，吸取上清液，重復(fù)以上步驟，合并上清液，氮氣吹干。用200 μL流動相復(fù)溶，再以12 000 r·min-1離心，取上清液20 μL進樣。

2.4分析方法的確證

2.4.1專屬性考察 取大鼠空白血漿[4，16]，按照2.3項下方法處理后進樣分析，獲得空白血漿色譜圖、空白血漿添加沒食子酸、4-乙酰氨基酚(內(nèi)標(biāo))色譜圖以及大鼠給藥后含藥血漿的色譜圖，見圖1。由圖1可知，沒食子酸和內(nèi)標(biāo)峰保留時間分別為7.0、13.3 min，二者分離度良好且無內(nèi)源性雜質(zhì)峰干擾，表明本實驗色譜條件適宜，提取處理方法合適，專屬性較強。

圖1 沒食子酸專屬性實驗典型色譜圖

2.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及定量下限 取200 μL空白血漿，加入2.2項下制備的沒食子酸對照品溶液(質(zhì)量濃度為0.05～20.00 μg·mL-1)100 μL，除不加100 μL 體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇(含體積分?jǐn)?shù)為1%的冰醋酸)外，其余按照2.3項下方法處理，得相應(yīng)系列質(zhì)量濃度(0.025～10.000 μg·mL-1)的血漿對照品溶液，分別進樣進行色譜分析。以沒食子酸質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)、沒食子酸與4-乙酰氨基酚峰面積之比(y)為縱坐標(biāo)，進行回歸分析，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.421 1x+0.022 5(r=0.999 9)，結(jié)果表明，沒食子酸質(zhì)量濃度在0.025～10.000 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為0.025 μg·mL-1。

2.4.3精密度和回收率實驗 取200 μL空白血漿[4，16]，分為日內(nèi)與日間2組，分別加入沒食子酸對照品適量，配制成質(zhì)量濃度分別為0.078、0.625、2.500、8.000 μg·mL-1的含藥血漿樣品溶液，加入內(nèi)標(biāo)4-乙酰氨基酚溶液，按照2.3項下血漿樣品處理方法提取處理，日內(nèi)組每日測定5次，日間組每日測定1次并連續(xù)測定5 d，記錄沒食子酸與4-乙酰氨基酚峰面積，代入回歸方程計算其質(zhì)量濃度。同法測定相對回收率。測定結(jié)果見表1。由表1可知，所有樣品的日內(nèi)精密度RSD值小于2.58%，日間精密度RSD值小于3.40%，平均相對回收率大于97.43%，符合生物樣品的質(zhì)量控制要求。

表1 沒食子酸在大鼠血漿內(nèi)的精密度、準(zhǔn)確度和相對回收率測定結(jié)果

取200 μL大鼠空白血漿，加入沒食子酸對照品適量，配制成質(zhì)量濃度分別為0.078、0.625、2.500、8.000 μg·mL-1的含藥血漿樣品溶液，加入內(nèi)標(biāo)4-乙酰氨基酚溶液，按照2.3項下血漿樣品處理方法提取處理，進樣后記錄沒食子酸峰與4-乙酰氨基酚峰面積比A1。另取2.2項下制備的相應(yīng)質(zhì)量濃度的對照品溶液直接進樣，記錄沒食子酸峰與4-乙酰氨基酚峰面積比A2。按公式計算絕對回收率(Rabs)，Rabs=A1÷A2×100%。結(jié)果表明，各組平均回收率分別為87.31%、88.79%、90.02%、91.56%，且在待測質(zhì)量濃度范圍內(nèi)RSD值均小于5%，符合生物樣品的質(zhì)量控制要求。

2.4.4穩(wěn)定性實驗 為了覆蓋預(yù)期樣本所處的不同實驗環(huán)境和條件，按照2.4.3項下方法配制沒食子酸質(zhì)控樣品，按照2.3項下方法處理并測定沒食子酸質(zhì)量濃度[4，16-17]。結(jié)果表明，短期(室溫下2 h)、長期(-80 ℃儲存1個月)、反復(fù)凍融(凍-融循環(huán)3次)穩(wěn)定性實驗中沒食子酸質(zhì)量濃度RSD值均小于15%，符合生物樣品的質(zhì)量控制要求。

2.5藥物動力學(xué)實驗 將32只雄性SD大鼠隨機分為4組，每組8只，實驗前禁食12 h，不禁水。其中3組大鼠灌胃(10 mL·kg-1)給予沒食子酸，劑量分別為50、100、200 mg·kg-1；另一組為靜脈給藥組，經(jīng)尾靜脈注射(2 mL·kg-1)給予沒食子酸10 mg·kg-1。灌胃給藥后于0、10、30、60、90、120、180、300、420、540、600 min，靜脈給藥后于0、2、5、10、20、30、45、60、90、120、180、240、300 min，分別從大鼠眼眶后靜脈叢采血400～500 μL，置于肝素化處理過的抗凝管中，以4 000 r·min-1離心15 min，分離血漿，按照2.3項下方法處理并測定沒食子酸質(zhì)量濃度。繪制得到大鼠血藥質(zhì)量濃度-時間曲線，見圖2。

圖2 不同劑量沒食子酸在大鼠體內(nèi)的平均血藥質(zhì)量濃度-時間曲線

運用DAS2.1軟件對血藥質(zhì)量濃度-時間參數(shù)進行非房室模型的統(tǒng)計矩法擬合，獲得沒食子酸單次不同劑量給藥后的主要藥物動力學(xué)參數(shù)，見表2。依據(jù)公式：絕對生物利用度(Fabs)=(AUC非靜脈×D靜脈)÷(AUC靜脈×D非靜脈)，計算不同劑量給藥后沒食子酸在大鼠體內(nèi)的Fabs，其中，AUC非靜脈為非靜脈給藥途徑藥時曲線下面積，D靜脈為靜脈給藥途徑給藥劑量，AUC靜脈為靜脈給藥途徑藥時曲線下面積，D非靜脈為非靜脈給藥途徑給藥劑量，結(jié)果見表2。

表2 不同劑量沒食子酸在大鼠體內(nèi)的藥物動力學(xué)參數(shù)

3 討論

3.1樣品處理方法的優(yōu)化 前期預(yù)實驗時對比了有機溶劑(乙腈、甲醇)沉淀法、強酸(1 mol·L-1鹽酸、體積分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸)沉淀法等直接沉淀樣品蛋白的方法，樣品經(jīng)處理后進樣分析所得色譜圖雜質(zhì)峰較多，且強度較強，對目標(biāo)峰造成一定干擾。后改用1 mol·L-1鹽酸預(yù)處理樣品溶液，再用乙酸乙酯分別萃取2次，合并萃取液經(jīng)氮氣吹干的方法[4]。采用該預(yù)處理方法進樣分析所得色譜圖，干擾峰較少，響應(yīng)信號全面，能夠滿足實驗需求。

3.2色譜條件的優(yōu)化 本實驗采用與沒食子酸分子結(jié)構(gòu)及保留時間相對接近的4-乙酰氨基酚為內(nèi)標(biāo)，采用甲醇-水洗脫系統(tǒng)對沒食子酸和4-乙酰氨基酚進行洗脫分離，當(dāng)甲醇-水的比例為5∶95時，沒食子酸和4-乙酰氨基酚色譜峰均與內(nèi)源性響應(yīng)信號峰分離良好[4]。由于結(jié)構(gòu)中強極性基團與反相色譜柱填料硅膠中的羥基之間的相互作用，沒食子酸和4-乙酰氨基酚在測定過程中均存在不同程度的拖尾現(xiàn)象，本實驗在洗脫系統(tǒng)中加入適量競爭性的有機酸(體積分?jǐn)?shù)為1.9%的冰醋酸)，可使硅膠羥基吸附達到飽和，從而有效改善峰形，增加峰對稱性。預(yù)實驗考察了依利特、Woburn、Kromasil等反相色譜柱的分離效果，結(jié)果顯示，Woburn Stamsil ODS-BP C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱的分離效果較好，故選用其為正式實驗分析測試柱。沒食子酸及4-乙酰氨基酚供試品經(jīng)二極管陣列檢測器掃描后均顯示在272 nm波長處有強吸收，故確定色譜檢測波長為272 nm。

3.3沒食子酸的藥物動力學(xué)研究 沒食子酸不同劑量灌胃給藥后，10 min即可在血漿樣品中被檢出，但血藥質(zhì)量濃度約在90 min才達到最大值。Konishi Y等[18]研究表明，沒食子酸跨腸上皮細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運方式為細(xì)胞旁路通道轉(zhuǎn)運，非極化且與pH值無關(guān)，推測沒食子酸的吸收速率受胞膜孔道數(shù)量及緊密連接蛋白表達程度的影響[19]。大鼠灌胃50、100、200 mg·kg-1沒食子酸后，Cmax隨劑量升高而成比例遞增，分別為(0.83±0.15)、(1.71±0.29)、(3.13±0.56) μg·mL-1，AUC0～t隨劑量增加而成比例遞增，分別為(137.07±24.75)、(262.55±22.05)、(501.64±31.64) mg·min·L-1，而MRT0～t、CL及t1/2相對恒定，表明在給藥劑量范圍內(nèi)，沒食子酸在大鼠體內(nèi)呈現(xiàn)典型的線性藥物動力學(xué)特征。此外，不同劑量沒食子酸灌胃后Vd分別為(78.52±8.51)、(89.60±10.53)、(83.56±10.64) L·kg-1，說明其在組織中可以廣泛分布。靜脈注射沒食子酸后，血藥質(zhì)量濃度在分布相下降迅速，至90 min后以較緩慢的速度從體內(nèi)消除，其CL約為0.061 L·min-1·kg-1。根據(jù)2.5項下公式計算得出沒食子酸的Fabs較低，平均值約為14.71。文獻報道[20]，大鼠口服沒食子酸后腹主動脈沒食子酸質(zhì)量濃度與門靜脈中的質(zhì)量濃度幾乎相同，藥物受腸道菌群及肝藥酶的影響較小。因此，與沒食子酸的首過效應(yīng)相比，腸道上皮細(xì)胞膜的透過性更可能是影響沒食子酸生物利用度的因素，這也提示我們在未來開發(fā)基于沒食子酸的新藥時應(yīng)設(shè)計更加適合其吸收的新型遞藥系統(tǒng)。