2,4-表油菜素內酯對鹽脅迫下紫花苜蓿生理指標及根系離子積累的影響

王文靜， 麻冬梅， 趙麗娟， 馬巧利

(寧夏大學西北土地退化與生態系統恢復省部共建國家重點實驗室培育基地/西北退化生態系統恢復與重建教育部重點實驗室， 寧夏 銀川 750021)

在農業生產中由于大量施用化肥、大水漫灌以及氣候等因素的變化，使得全球鹽堿化土壤面積不斷擴增[1]。鹽脅迫會導致滲透脅迫、離子毒害及離子分布不平衡，阻止植物對礦質營養的吸收和攝取、損害細胞的結構、擾亂細胞的生理代謝，嚴重影響植物的生長發育[2-6]。同時鹽脅迫影響植物葉片的光合作用和呼吸作用，降低植物吸水性[7]，抑制根系對植物必需營養元素的吸收，造成植株營養虧缺[8]，生育期變短，最終導致作物減產[9]。由于鹽堿脅迫對植物生長造成的巨大危害，尋找對鹽堿脅迫具有抑制作用的物質以提高作物產量和改善鹽堿地方面具體重要意義。

2，4-表油菜素內酯(2,4-Epibrassinolide，EBR)是一類對植物生長和發育具有重要影響的新激素，可促進植物體內蛋白質合成，提高植物酶活性并參與植物體其他生理過程[10-13]。張紅[14]研究表明鹽脅迫下玉米(ZeamaysL.)種子經EBR處理可提高發芽率和出苗整齊度；謝云燦等[15]研究表明，噴施外源EBR預處理不但可以通過提高常溫和高溫條件下大豆(Leguminosae)葉片的光合能力、促進干物質積累、提高產量，而且提高了籽粒中蛋白質含量、改善了籽粒品質；陸曉民等[16]研究發現，低氧脅迫下噴施EBR后黃瓜(CucumissativusLinn.)幼苗根系的線粒體抗氧化酶活性升高，超氧陰離子產生速率、過氧化氫含量、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量降低，根尖細胞受損害程度降低，從而減輕了鹽脅迫對植物造成的傷害；寇江濤等[17]研究表明，EBR可增強鹽脅迫下紫花苜蓿(Medicagosativa)根系的活性氧清除能力，降低植物體內活性氧含量。因此，EBR在增強植株抗逆性、提高抗氧化酶活性和調節光合作用方面起著重要作用[18-19]。

苜蓿(Medicagosativa)作為優質的豆科類牧草，被譽為“牧草之王”[20]。苜蓿具有較強的耐鹽性，其葉片對鹽分侵害具有一定的抵抗能力，因此也是一類改善鹽堿地狀況的理想作物[21]。目前，國內外諸多學者主要圍繞糧食類作物[8，13]、豆類作物[9]和蔬菜類作物[10，12，14]利用EBR增強植物耐鹽性進行了大量研究，而針對不同激素濃度對紫花苜蓿幼苗材料的研究相對較少，且研究領域以光合特性和膜滲透調節為主，而對鹽脅迫條件下植物體內關鍵酶活性和離子吸收分配的調節效應缺乏機理性研究。為此，本研究以紫花苜蓿‘阿迪娜’為試驗材料，探究外源激素EBR對鹽脅迫下苜蓿幼苗生理特性及離子分配與吸收的影響，以期為利用EBR增強苜蓿耐鹽性能的生理機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

試驗選擇紫花苜蓿‘阿迪娜’為材料，該材料來自于寧夏大學種質資源庫。于2019年5—9月在寧夏大學西北退化生態系統恢復與重建教育部重點實驗室人工氣候室(38°30′ N，106°8′ E)進行試驗。苜蓿種子用0.1% HgCI2消毒8 min，然后用75%酒精消毒30 s，再用蒸餾水漂洗5～6遍，將清洗消毒之后的種子均勻鋪在放好濾紙的培養皿中，并將濾紙用蒸餾水噴濕，放入人工培養箱培養至種子發芽(24～26℃)。待幼苗長至兩葉一心時移至裝有3L Hoagland，s營養液的水培箱進行培養，每3 d更換一次營養液。在營養液中培養30 d后開始處理。

試驗設置 5個處理，分別為CK(澆灌營養液)、150 mmol·L-1NaCl(N)，150 mmol·L-1NaCl+0.3 μmol·L-1EBR(M1)、150 mmol·L-1NaCl +0.6 μmol·L-1EBR(M2)、150 mmol·L-1NaCl +1.2 μmol·L-1EBR(M3)，每個處理3個重復。連續處理7 d后測定各項指標。

1.2 指標測定

生理指標測定方法：超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD) 活性測定采用氮藍四唑光還原法；過氧化物酶(Peroxidase,POD)活性采用愈創木酚法測定吸光值；過氧化氫酶(Catalase,CAT)活性采用紫外吸收法測定；丙二醛含量采用李合生的硫代巴比妥酸法測定；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍染色法，具體步驟可參考趙世杰等的測定方法[22]。

無機離子含量測定：將植株的根系用去離子水潤洗干凈，并將水分用吸水紙吸干，采用干燥法對干物質量進行測定。將各處理的干樣粉碎、研磨和過篩，根據毛美飛等[23]方法測定Na+，K+，Ca2+，Mg2+含量。

1.3 數據處理與分析

采用Excel 2010對數據進行統計分析和作圖，用SPSS 18.0軟件中的鄧肯新復極差法進行單因素方差分析和多重比較(LSD<0.05)、相關性分析，并用不同字母標注差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 外源激素EBR對紫花苜蓿幼苗生長及表型的影響

與CK相比，150 mmol·L-1NaCl降低了紫花苜蓿生長指標，其中根長變化最明顯，降幅達45.3%。M1處理各項指標變化小，與CK差異不顯著。M2，M3處理根長和根粗與CK相比有所提高(表1)。由于水培條件下鹽溶液中的Na+和CI-1可直接迅速侵入根系，因此在脅迫后很短的時間內苜蓿幼苗就出現萎蔫現象，但在噴施不同濃度的外源激素EBR 2～3 h后，幼苗莖葉萎蔫現象緩解，逐漸恢復到鹽脅迫前的表型(圖1)。說明就表型特征而言，外源激素EBR對鹽脅迫的危害具有一定緩解作用。

表1 外源激素EBR對鹽脅迫下苜蓿幼苗生長的影響Table 1 Effects of exogenous EBR on the growth of Alfalfa seedlings under salt stress

圖1 外源激素EBR對鹽脅迫下苜蓿幼苗表型的影響Fig.1 Effect of exogenous hormone EBR on alfalfa seedling phenotype under Salt Stress

2.2 外源激素EBR對NaCI脅迫下苜蓿幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

由圖2可知，鹽脅迫會大幅度降低苜蓿幼苗葉片的抗氧化酶活性。葉片中SOD，POD，CAT活性隨著EBR濃度的升高出現下降—上升—下降的趨勢，并最終低于對照。與150 mmol·L-1NaCl脅迫相比，M1，M2和M3處理時苜蓿幼苗的抗氧化酶活性均升高，且M2處理下升高趨勢達顯著性差異，說明外源激素EBR濃度為0.6 μmol·L-1時可以顯著提高紫花苜蓿幼苗的抗氧化酶活性，減輕鹽脅迫對苜蓿幼苗生長的影響。

圖2 外源激素EBR對NaCI脅迫下苜蓿幼苗葉片抗氧化酶活性的影響Fig.2 Effect of exogenous hormone EBR on antioxidant enzyme activity of alfalfa seedlings under NaCl stress

2.3 外源激素EBR對NaCI脅迫下苜蓿幼苗葉片丙二醛含量及電解質滲透率的影響

由圖3可知，150 mmol·L-1NaCl脅迫處理下，苜蓿幼苗葉片中的電解質滲透率和MDA含量升高，顯著高于對照(P<0.05)。鹽脅迫下添加0.6 μmol·L-1外源激素EBR顯著降低了NaCl脅迫導致的電解質滲透和MDA積累。丙二醛含量越高，對膜和細胞造成的傷害越大，說明外源激素EBR可以減少鹽脅迫對植物細胞過氧化的危害，提高植株對逆境脅迫的適應性。

圖3 外源激素EBR對NaCI脅迫下苜蓿幼苗葉片丙二醛含量及電解質滲透率的影響Fig.3 Effects of exogenous hormone EBR on MDA content and electrolyte permeability of alfalfa seedling leaves under NaCI Stress

2.4 外源激素EBR對NaCI脅迫下苜蓿幼苗葉片可溶性蛋白含量的影響

由圖4可知，與對照相比，鹽脅迫處理下苜蓿幼苗的可溶性蛋白含量顯著下降(P<0.05)；鹽脅迫時噴施不同濃度外源激素EBR后，幼苗葉片可溶性蛋白質含量均有提高，M2處理上升趨勢最明顯，但含量均低于沒有鹽脅迫影響。說明鹽脅迫使苜蓿幼苗體內的可溶性蛋白含量降低，影響植物體內氮素的形成和正常的滲透勢過程，破壞可溶性蛋白對植物細胞和生物膜的保護作用，而適當濃度(0.6 μmol·L-1)的外源激素EBR可以抑制鹽脅迫的部分影響。

圖4 不同處理下可溶性蛋白含量變化Fig.4 Changes of soluble protein content under different treatments

2.5 外源激素EBR對鹽脅迫下苜蓿幼苗無機離子含量的影響

150 mmol·L-1NaCl處理下苜蓿幼苗根系中的Na+含量顯著升高，K+，Ca2+和Mg2+含量顯著降低(P<0.05)(圖5)。和CK相比，NaCl處理苜蓿幼苗葉片中的Na+含量提高了32.8%(P<0.05)，K+，Ca2+，Mg2+含量分別降低了57.1%，69.7%和19.2%。由圖5可知，M1處理Na+含量與對照相比上升，與鹽脅迫處理相比含量下降；M1處理K+含量較對照下降了22.8%(P<0.05)，比鹽脅迫處理略有上升；M1處理Ca2+和Mg2+含量均低于CK處理，但高于鹽脅迫處理，分別提高了30.7%和29.1%。M2處理苜蓿幼苗根系的Na+含量顯著低于NaCl處理的Na+離子含量，K+，Ca2+和Mg2+含量均遠遠高于NaCl處理，分別提高53.8%，66.7%，31.2%(P<0.05)。M3處理其離子含量變化趨勢同M2，Na+含量低于鹽脅迫處理，K+,Ca2+和Mg2+含量均高于鹽脅迫。綜上所述，150 mmol·L-1NaCl使植物體內K+，Ca2+和Mg2+等陽離子含量下降，噴施外源激素EBR可以有效減小鹽脅迫的危害并且控制植物體內離子平衡和對植株根系生長的影響以及根系對水分和營養物質的正常吸收促進，0.6 μmol·L-1EBR為紫花苜蓿較為適應的激素濃度。

3 討論

在我國南北方許多地區存在大量鹽堿地，對各類植物造成危害，不同基因型植物對鹽害的適應能力不同[26]。有大量研究報道，土壤中的含鹽量在超過0.2%～0.25% 時就會對敏鹽植株正常生長造成危害，耐鹽植物可忍受鹽分濃度為0.5%～1.8%。在我國西北地區、華北地區、東北部分和海濱等地分布有大量鹽堿地，總面積大約(2～7)×107ha[27]。鹽脅迫條件下，敏鹽種子的萌發受到抑制，同時植株的發芽率、干鮮重等顯著降低。寇江濤[17]、王小山[18]等研究表明，外源激素EBR可以緩解鹽脅迫對植株生長造成的影響。本試驗中，施加微量外源激素EBR便可提高紫花苜蓿幼苗中的抗氧化酶活性，使植株的可溶性蛋白含量增加，而對苜蓿幼苗的丙二醛含量和電解質滲透率具有一定的抑制作用，抗氧化酶可以有效地清除膜質過氧化物對植物造成的傷害，其活性越高，植物對逆境的適應能力越強[19]，因此外源激素EBR可在一定程度上緩解膜脂過氧化對苜蓿幼苗造成的傷害，增強植物對逆境脅迫的抵抗能力，減輕鹽脅迫對苜蓿幼苗生長的影響，這一結論也與梁超[24]、鄒琦[25]等的研究結果相似。相對而言鹽溶液明顯抑制抗氧化酶活性，提高丙二醛含量和電解質滲透率，這也和前人的研究結果相似[14-18]。由此可知，適量濃度的外源激素EBR對鹽脅迫的抑制作用明顯，可加強植物的耐鹽性，對鹽脅迫生態系統的改善具有很好的效果。

在對離子的研究方面，K+影響著植物體的水分和光合利用,淀粉以及蛋白質合成，是構成細胞滲透勢的主要離子[28]，其濃度高低對氣孔的開閉有調節作用。Ca2+調節植物體的許多生理代謝過程，在植物的信號傳導過程中充當第二信使[29]，能夠提高植物對逆境的適應性。Mg2+與植物的光合作用密切相關，是組成葉綠素的重要分子，確保光合磷酸化的正常進行[30]。本試驗中，NaCl脅迫下紫花苜蓿根中的K+，Ca2+，Mg2+含量顯著下降，Na+含量顯著升高，表明濃度較高的Na+對K+，Ca2+，Mg2+3者的吸收有抑制作用，打破了植物體內的正常離子含量和離子分布；較低濃度的外源激素EBR (0.6 μmol·L-1)可以降低植株體內的Na+含量，提高植株體內其他離子含量，維持離子平衡。以上結果可能是由于外源激素EBR提高了NaCl脅迫下植物的根系活力和光合能力[31]，同時外源激素EBR可以調控植物根系中內源植物激素的合成[32]，從而有效調控無機離子的吸收、運輸和分配，減少鹽脅迫危害。

4 結論

極低濃度的外源激素EBR可以有效地減輕鹽脅迫的危害，使植物體內的超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶活性升高，葉綠素含量和可溶性蛋白含量增加，丙二醛含量以及電解質滲透率下降；并且外源激素EBR可有效抑制Na+對K+，Ca2+,Mg2+的毒害，控制離子平衡；0.6 μmol·L-1EBR為紫花苜蓿受鹽脅迫較為適應的激素濃度。不同物種在逆境條件下對外源激素EBR的適應程度有差異，EBR可以快速有效地影響苜蓿等一些牧草生長，對提高鹽堿地牧草對逆境的耐受力，提高產量，改善生長狀況具有重要意義。