添加辣木葉和香腸乳桿菌對玉米秸稈青貯品質的影響

呂竑建， 鄒 璇， 吳 碩， 李 云， 陳曉陽*， 張 慶*

(1.華南農業大學動物科學學院， 廣東 廣州 510642； 2. 華南農業大學林學與風景園林學院， 廣東木本飼料工程技術研究中心，廣東省森林植物種質創新與利用重點實驗室， 廣東 廣州 510642； 3. 北京林業大學生物科學與技術學院， 北京 100083)

玉米(Zeamays)秸稈是世界上常見的農業副產品之一，其年產生物量超過11.3億噸[1]。大部分的玉米秸稈都被焚燒處置，不僅造成了資源的浪費，同時帶來了環境污染問題[2-3]。將玉米秸稈做成青貯飼料不僅能減少環境污染，且能緩解飼料短缺問題[4]。但玉米秸稈青貯飼料的局限性體現在其消化率和營養價值較低，作為單一飼料原料飼喂時難以滿足動物日常營養需求，這是由于其木質纖維素和半纖維素含量高，蛋白質、氨基酸和礦物質含量較低，不利于有效微生物的生長。要提高玉米秸稈青貯的發酵質量，改善其營養價值和適口性，混合青貯是一個有效的辦法[5]。

辣木(MoringaOleifera)，起源于印度，營養價值豐富，每一個部分都能被充分利用，且辣木能在非常惡劣的環境下存活，在全球廣泛種植，蛋白質，維生素和微量元素含量高，是我們日常食用的水果蔬菜等食品的數倍[6-7]。鑒于辣木的特性，它可以用作飼料添加劑來改善飼料成分和利用效率，提高動物的健康水平[8-9]。Rubanza[10]報道將辣木作為飼料添加劑可以提高動物飼料消化率。Kholif[11]報道用辣木替代75%干物質的苜蓿(MedicagoSativa)，能提高哺乳期努比亞山羊的飼料利用率，改善瘤胃發酵，提高奶產量和質量。不僅如此，Wang[12]也報道用辣木葉和苜蓿或柱花草(Stylosanthesguianensias)混合青貯，能提高它們的營養價值和發酵品質。有氧穩定性是青貯飼料加工的重要指標，Wilkinson[13]研究發現玉米秸稈青貯容易在有氧環境下出現腐敗，引起干物質損失甚至產生有毒物質。添加乳酸菌不僅可以改善玉米秸稈的青貯品質[14]，而且能提高青貯飼料的有氧穩定性，Ranjit[15]研究發現，在玉米秸稈青貯中添加布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri，LB)，能顯著改善其有氧穩定性。根據我們此前的研究，在辣木青貯中分離出的香腸乳桿菌(Lactobacillusfarciminis，LF)，可以提高青貯飼料的品質，對有氧穩定性的效果還有待探索[16]。

南方天氣高溫多雨，飼料保存難度大，容易出現霉變等腐敗現象，然而飼料安全對動物養殖生產具有極其重要的意義，青貯是保存青綠飼料的一個經濟便捷的方式。玉米秸稈的產量大，但營養價值低，混合辣木葉青貯可改善其營養品質，為我國南方地區提供優質的飼料資源。但有關于利用木本飼料混合青貯的方式改善其他牧草青貯品質的研究比較少，有關有氧穩定性的研究更是少之又少。所以，本試驗采用完全隨機試驗設計，設置了100%玉米秸稈，80%玉米秸稈+20%辣木葉，60%玉米秸稈+40%辣木葉及是否添加LF共6個組別，在60 d青貯后測定了發酵品質等指標，并對青貯開袋后的8 d內的有氧穩定性進行了記錄。旨在研究添加辣木葉和乳酸菌LF對玉米秸稈青貯品質，營養成分和有氧穩定性的影響，對開發木本飼料資源與現實生產提供理論依據和指導意義。

1 材料與方法

1.1 乳酸菌的制備

試驗所用的辣木種植于華南農業大學試驗田，并于2019年5月人工采葉，采葉后用鍘刀進行切割，長度約2 cm，將切碎的辣木葉混合均勻，按照試驗設計分裝至聚乙烯塑料袋(20 cm×30 cm)中，每袋約200 g，真空封口機抽真空并密封保存。參照Zhang[17]的研究，經過60 d青貯發酵后，分離出96株乳酸菌菌株，并鑒定和篩選出LF，用于后續青貯試驗。

1.2 試驗設計

試驗中的辣木和玉米均種植于華南農業大學試驗田，玉米秸稈于玉米籽實收獲后立即收割，辣木葉于第一次刈割后40天收割，采摘后處理和青貯方法同上。試驗采用雙因素完全隨機試驗，因素Ⅰ為辣木葉的添加量，因素Ⅱ是LF乳酸菌添加劑，添加量為1×106cfu·g-1鮮樣(Fresh matter，FM)，分為6個組，分別是CK(空白對照組)，20%M(20%辣木葉和80%玉米秸稈混合青貯)，40%M(40%辣木葉和60%玉米秸稈混合青貯)，CK+LF(空白對照組+LF)，20%M+LF(20%辣木葉和80%玉米秸稈混合青貯+LF)，40%M+LF(40%辣木葉和60%玉米秸稈混合青貯+LF)，M代表辣木葉，每組9個重復，共54袋青貯。封裝后在室溫下保存，在60 d后進行開袋，對其化學成分，青貯品質和有氧穩定性進行測定分析。

1.3 有氧穩定性

參照Zhang[17]的方法對有氧穩定性進行測定。開袋后，每3袋收集400 g青貯，松散地放置在體積為1 L的塑料罐中，以評估有氧穩定性，共18罐，罐上覆蓋一層紗棉布，讓空氣可以滲入青貯飼料，同時防止青貯變干和污染。所有的罐子都存放于紙箱(90 cm×50 cm×60 cm)中并以聚苯乙烯泡沫填滿空間。每隔10 min測量一次室溫和每個塑料罐的溫度，記錄儀型號(SMOWMDL-1048A，上海天河自動化儀器有限公司，中國上海)。

1.4 微生物及化學指標的測定

青貯開袋后，將20 g樣品與180 mL無菌生理鹽水溶液充分混合，并將其濃度依次從10-1稀釋至10-6倍，得到不同濃度的樣品浸提液，以平板計數法測定乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)、大腸桿菌(Coliform bacteria)、酵母菌(yeast)和霉菌(molds)的數量，乳酸菌采用MRS瓊脂培養基，大腸桿菌采用結晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養基(Violet Red Bile Agar,VRBA)，酵母菌和霉菌采用孟加拉紅培養基(虎紅瓊脂)。培養基均購自廣東環凱微生物科技有限公司。為了檢測pH值和有機酸含量，將20 g樣品與180 mL無菌純水充分混合，并置于4℃冰箱內18 h，取出過濾后即可測試pH值，剩余液體通過0.22 μm孔徑的濾膜即可測定有機酸含量。氨態氮(Aammonium nitrogen，NH3-N)含量的測定方法參照Broderick[18]的方法。干物質(Dry matter，DM)含量的測定方法為在65℃烘箱內烘干48 h后計算。將烘干后的樣品用粉碎機粉碎后置于干燥器保存，粗蛋白質(Crude protein，CP)含量的測定依照AOAC[19]的方法；非蛋白氮(Nonprotein nitrogen，NPN)和真蛋白質(True protein，TP)的含量測定方法參照Licitra[20]的方法；中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber，ADF)的測定方法參照Van soest[21]的方法；可溶性糖(Water-soluble carbohydrates，WSC)的測定采用蒽酮比色法[19]。

1.5 數據統計

采用SPSS 19.0 進行雙因素方差分析(Two-way ANOVA)，兩個因素互作時用Duncan氏對各組進行多重比較，P< 0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 青貯原料

如表1所示，玉米秸稈和辣木葉原料的特性。玉米秸稈原料的干物質含量16.4%，CP含量為9.01%DM，NDF和ADF的含量為63.8%和36.1%DM，WSC含量為4.17%DM。微生物包括乳酸菌、酵母菌、大腸桿菌和霉菌，數量分別為6.54，4.39，7.23和4.55 lgcfu·g-1FM。辣木葉原料的干物質含量20.4%，CP含量為22.1%DM，NDF和ADF的含量為23.3%和17.2%DM，WSC含量為7.36%DM。微生物包括乳酸菌、酵母菌、大腸桿菌和霉菌，數量分別為5.72，3.53，7.00和<2.00 lgcfu·g-1FM。

表1 青貯原料的特性(± SD,n=3)Table 1 The characteristics of materials for ensiling (± SD,n=3)

2.2 秸稈辣木混合青貯60 d的青貯品質

如表2所示，玉米秸稈和辣木葉的青貯60 d后的青貯品質。添加辣木葉或LF均對DM無顯著影響。添加辣木葉可以顯著降低pH值(P<0.01)和大腸桿菌數量(P<0.01)，同時提升乳酸含量(P<0.01)。乳酸菌數量在添加40%辣木葉時顯著降低(P<0.05)。乙酸含量在添加辣木后均有所下降，但僅在20%M組有顯著差異(P<0.05)。辣木葉與LF的交互作用對乳酸菌，大腸桿菌和酵母菌的數量均有顯著影響(P<0.05)。

表2 混合青貯60 d發酵品質(n=3)Table 2 The fermentation quality of the mixed silages after 60 d of ensiling (n=3)

2.3 秸稈辣木混合青貯60 d營養成分

表3 混合青貯60天營養成分(n=3)Table 3 The nutritional components of the mixed silages after ensiling for 60 days(n=3)

2.4 辣木秸稈青貯的有氧穩定性

如圖1所示，開袋后8 d內溫度變化的趨勢。添加辣木葉后降低了青貯開袋后的有氧穩定性，但在添加LF后，有氧穩定性有明顯的提升，并無有氧腐敗的現象(表4)。達到最大溫度用時為0的組別(CK，CK+LF，20%M+LF，40%M+LF)代表初始溫度即為整個試驗期內的最高溫度。

表4 青貯60 d后開袋8 d內有氧穩定性(n=3)Table 4 The aerobic stability of the mixed silages 8 days after exposure to air

圖1 混合辣木葉和添加乳酸菌LF對玉米秸稈青貯60 d后有氧暴露8 d溫度變化的影響Fig.1 Effect of Moringa Oleifera leaves addition on the temperature dynamics of corn stover ensiled with/without LF for 60 days and subsequently exposure to air for 4 days

3 討論

3.1 玉米秸稈與辣木葉原料的特點

本試驗中玉米秸稈的粗蛋白質含量高于周瑞[22]的研究。辣木葉原料的粗蛋白質含量高于王成[23]報道的16.72%DM，而NDF，ADF和WSC的含量均低于其報道。但是辣木葉的WSC含量達到了張慶[24]報道的制作優質青貯飼料并良好保存的標準。原料的營養成分含量不同，可能是不同的地理位置、氣溫、品種和作物生長期等因素導致[23]。另外，兩種原料的乳酸菌數量都達到了Cai[25]報道的良好青貯原料的標準(> 5.0 lg cfu·g-1)，但原料中較多的大腸桿菌數量可能會影響青貯效果。同時，玉米秸稈纖維含量高，WSC和DM含量低，青貯效果不理想[26-27]。將WSC含量低的飼草與WSC含量高的牧草混合青貯是改善青貯飼料質量的常見方法[5]。辣木葉蛋白質含量高，纖維含量低，是動物飼料的優質蛋白質來源。因此，將辣木葉與玉米秸稈混合青貯可提高其營養價值和青貯品質。

3.2 秸稈辣木葉混合青貯60 d的青貯品質

添加辣木葉混合青貯后，pH值顯著降低，大腸桿菌數量顯著下降。pH值是衡量青貯品質的重要指標[28]，一般來說，pH值<4.2表示青貯飼料的發酵品質良好[25]，較低的pH值還能抑制大腸桿菌的生長。據報道，辣木是一種有效的抗菌植物，能減少飼草中常見的有害微生物[29-30]，說明辣木葉在青貯中可能有一定的抗菌性能。乳酸菌數量的下降應該是較低的pH值所致，Ohmomo報道很多乳酸菌菌株對pH值<4.0的環境耐受性較弱[31]。本試驗中，酵母菌僅出現在20%M和40%M組，Muck[28]報道稱大部分酵母菌能在pH值為3.5的環境下存活，這遠低于一般青貯飼料足以抑制大多數有害微生物的pH值。此外，添加辣木葉提高了乳酸和WSC含量，給酵母菌提供了生長條件。由于酵母菌在好氧條件下會引起青貯飼料變質，因此酵母菌數量的增加值得引起注意[4,28]。乙酸的產生常是由于乳酸被分解，添加辣木葉降低了乙酸的含量。此外，添加LF能抑制有害微生物的生長，說明LF能改善飼料的青貯品質。以上結果表明添加辣木葉和LF都能提升玉米秸稈的青貯品質。

3.3 秸稈辣木葉混合青貯60 d的營養成分

添加辣木葉可以顯著降低氨態氮含量，可能是辣木葉抑制了梭菌等微生物的生長和蛋白質的水解活動。另一方面，Guo[32]報道辣木葉中的單寧成分可以抑制青貯飼料中的蛋白質水解。添加辣木葉顯著增加了蛋白質含量，同時顯著降低了纖維成分的含量。高水平的膳食纖維可能會使動物消化能損失，降低礦物質利用效率，并對生物生殖指標產生負面影響[33]。WSC含量在添加辣木葉后也有所提升(添加LF組)，一般來說，WSC含量代表青貯飼料發酵中糖的消耗。低pH值環境可能會抑制微生物的活動從而抑制青貯飼料的發酵[4]。WSC含量與乳酸含量相關，試驗組中WSC含量低時，乳酸含量較高，發酵效果較好。從CK與CK+LF兩組對比，可以看出，添加LF對促進玉米秸稈發酵有積極意義。不過，無LF組的WSC含量相近，且平均值比添加LF組高，也有可能是纖維酸水解導致的。

3.4 秸稈辣木葉混合青貯的有氧穩定性

有氧穩定性的定義為青貯飼料的核心溫度高于外界溫度2℃所需要的時間，是衡量青貯飼料質量的重要指標之一。有氧腐敗會使飼料的營養價值下降，且降低動物的采食量[34]。當飼料暴露于空氣中時，引起有氧腐敗的主要因素是酵母菌，將碳水化合物和乳酸分解成水和二氧化碳[17]。從表4可知，僅2組出現了有氧腐敗(20%M和40%M)。從圖1可知，20%M和40%M2組均從第一天開始出現有氧腐敗的現象，并一直保持較高的溫度，而其他組未出現有氧腐敗現象。出現有氧腐敗的2組，正好是檢測出酵母菌的2組，所以有氧腐敗很可能是相關酵母菌引起的。He[35]也報道了類似的情況，添加辣木后降低了青貯的有氧穩定性，可能是由于辣木葉提高了青貯中乳酸和WSC含量，且降低了乙酸和丙酸等抗菌成分的含量。但是，通過添加LF可明顯提高青貯的有氧穩定性，即使添加了辣木葉的玉米秸稈青貯也未出現有氧腐敗，可能是LF抑制了酵母菌的生長。通過以上的試驗結果表明，添加辣木葉可以改善玉米秸稈青貯的發酵質量，提高營養價值，而添加LF可提高玉米秸稈青貯的有氧穩定性。

4 結論

本研究表明，在玉米秸稈青貯中添加辣木葉可降低pH值、大腸桿菌數量，使乙酸、氨態氮、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的含量下降，同時辣木葉可以增加蛋白質和乳酸含量，但會降低青貯的有氧穩定性。香腸乳桿菌可以減少玉米秸稈青貯中大腸桿菌和酵母菌的數量，同時提高青貯的有氧穩定性。因此，將辣木葉與玉米秸稈混合青貯時，添加香腸乳桿菌能得到發酵效果更好，品質更優的青貯飼料。