不同胃黏膜病變中l(wèi)ivin、survivin、Pak-1和caspase-7的表達及其意義

姜姝羽 任麗梅 武金寶 婁佳欣 蘇琪皓 劉小芳

內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院1(014040) 包頭醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科2

胃癌是目前世界上常見的惡性腫瘤之一，其組織學演變遵循Correa級聯(lián)反應(yīng)，即慢性非萎縮性胃炎(chronic non-atrophic gastritis, CNAG)-慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis, CAG)-胃黏膜腸化生-異型增生-胃癌，其中腸化生是重要的癌前病變[1-2]。Livin和survivin均屬于凋亡抑制蛋白家族，是細胞凋亡中重要的調(diào)節(jié)因子，可抑制凋亡信號轉(zhuǎn)導過程中的caspase-3/7/9蛋白的活性[3]。p21蛋白活化激酶-1(p21 activated kinase-1, Pak-1)是一種進化保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[4]。本研究通過采用免疫組化染色檢測胃癌及其癌旁、腸化生、CNAG組織中l(wèi)ivin、survivin、Pak-1和caspase-7的表達，旨在探討三者在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，從而為胃癌的預防和診療提供理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料來源

選取2015年1月—2019年12月包頭醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院病理科確診的45例原發(fā)性胃腺癌組織和相應(yīng)癌旁組織(距腫瘤組織5 cm以上)，其中男25例，女20例；年齡45～80歲，平均62歲；低分化24例，中分化14例，高分化7例；腫瘤分期根據(jù)美國癌癥分期聯(lián)合委員會(AJCC)的第8版胃癌TNM分期，Ⅰ+Ⅱ期者16例，Ⅲ+Ⅳ期者29例。所有組織均在外科手術(shù)或內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)中獲取。另選取經(jīng)病理檢查確診的CNAG組織45例、腸化生組織45例，均無其他惡性腫瘤史，術(shù)前未行任何抗癌治療。所有患者中男72例，女63例，年齡40～80歲，平均60歲。本研究方案已通過包頭醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批。

二、主要試劑

Livin、survivin、Pak-1和caspase-7兔抗人多克隆抗體(工作濃度均為1∶400)均購于美國Proteintech Group, Inc.，免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

三、免疫組化法

對組織切片先后進行免疫組化PV-9000二步法染色、DAB顯色、蘇木精復染、封片等，詳細步驟依照試劑盒說明書操作。以PBS液代替一抗作為空白對照，已知陽性組織切片作為陽性對照。

結(jié)果判斷：采用雙盲法，由2名經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師獨立觀察，若計數(shù)相差10%以上則重新計數(shù)。Livin、survivin主要表達于細胞質(zhì)和(或)細胞核中，Pak-1主要表達于細胞質(zhì)和(或)細胞膜中，caspase-7主要表達于細胞質(zhì)中。高倍鏡(×400)下隨機選取5個視野進行觀察，總?cè)旧u分為陽性細胞比例評分與染色強度評分之積，陽性細胞比例評分標準：<5%，0分；5%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；75%，4分。染色強度評分標準：基本不著色，0分；淺黃色，1分；棕黃色，2分；棕褐色，3分。總評分0～2分為陰性表達，≥3分為陽性表達。

四、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件，率的比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、各組livin、survivin、Pak-1和caspase-7表達情況

在不同胃黏膜組織中，livin的陽性染色主要位于細胞質(zhì)和(或)細胞核(圖1)，survivin的陽性染色主要位于細胞質(zhì)和(或)細胞核(圖2)，Pak-1的陽性染色主要位于細胞質(zhì)和(或)細胞膜(圖3)，caspase-7的陽性染色主要位于細胞質(zhì)(圖4)。

A：胃癌；B：腸化生；C：CNAG；D：癌旁組織圖1 Livin在不同胃黏膜組織中的表達(免疫組化染色，×100)

A：胃癌；B：腸化生；C：CNAG；D：癌旁組織圖2 Survivin在不同胃黏膜組織中的表達(免疫組化染色，×100)

A：胃癌；B：腸化生；C：CNAG；D：癌旁組織圖3 Pak-1在不同胃黏膜組織中的表達(免疫組化染色，×100)

A：胃癌；B：腸化生；C：CNAG；D：癌旁組織圖4 Caspase-7在不同胃黏膜組織中的表達(免疫組化染色，×100)

胃癌組livin、survivin、Pak-1的陽性表達率明顯高于腸化生組、CNAG組和癌旁組(P<0.05)，腸化生組又明顯高于CNAG組和癌旁組(P<0.05)，而CNAG組與癌旁相比無明顯差異(P0.05)。胃癌組caspase-7的陽性表達率明顯低于腸化生組、CNAG組和癌旁組(P<0.05)，腸化生組又明顯低于CNAG組和癌旁組(P<0.05)，而CNAG組與癌旁組相比無明顯差異(P0.05；表1)。

表1 各組中l(wèi)ivin、survivin、Pak-1和caspase-7表達情況n(%)

二、Livin、survivin、Pak-1和caspase-7表達與胃腺癌臨床病理特征的關(guān)系

Livin、survivin、Pak-1和caspase-7表達與胃癌患者分化程度、TNM分期、浸潤深度和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)(P<0.05)，而與胃癌患者性別、年齡、腫瘤大小無關(guān)(P0.05；表2)。

討 論

Livin通過拮抗caspase-3、caspase-7、caspase-9和第2個線粒體衍生的半胱氨酸蛋白酶激活劑/低等電位點的凋亡抑制蛋白的直接結(jié)合蛋白的活性來抑制腫瘤細胞凋亡[5]。本實驗結(jié)果表明，livin的陽性表達率在胃癌組、腸化生組、CNAG組和癌旁組中呈下降趨勢，且胃癌組中陽性表達率明顯高于腸化生組、CNAG組和癌旁組，這與孟加榕等[6]的研究結(jié)果一致。同時，腸化生組livin陽性表達率又明顯高于CNAG組和癌旁組，而CNAG組與癌旁組無明顯差異。提示livin表達上調(diào)可能在胃黏膜由炎癥向腸化生以及惡性轉(zhuǎn)化中扮演重要角色，腸化生可能是胃黏膜由良性病理階段向胃癌階段發(fā)展的危險過渡階段，是進行干預的最佳節(jié)點。

Survivin通過抑制caspase-3和caspase-7的活性抑制細胞凋亡，還通過調(diào)節(jié)細胞周期對抗G2/M期凋亡的誘導，使細胞逃離凋亡檢查點。此外，survivin還與血管內(nèi)皮生長因子共同調(diào)節(jié)腫瘤血管，促進腫瘤生成[7-8]。本實驗結(jié)果表明，survivin的陽性表達率在胃癌組、腸化生組、CNAG組和癌旁組中呈下降趨勢，且胃癌組中陽性表達率明顯高于腸化生組、CNAG組和癌旁組，這與董麗麗等[9]的研究結(jié)果一致。同時，腸化生組survivin陽性表達率又明顯高于CNAG組和癌旁組，而CNAG組與癌旁組無明顯差異。提示在慢性胃炎向胃癌演變的過程中，survivin蛋白的凋亡抑制作用逐步加強，部分異常細胞失去survivin介導的凋亡控制，導致細胞凋亡與增殖失衡，從而發(fā)生胃癌。

Pak-1由一個C末端激酶區(qū)和一個N末端調(diào)節(jié)區(qū)構(gòu)成，其N末端調(diào)節(jié)區(qū)含有GTP酶結(jié)合區(qū)域，參與細胞表面和細胞內(nèi)各種信號級聯(lián)過程，從而影響細胞周期、增殖與凋亡、炎癥發(fā)生、代謝等生理過程[10]。本實驗結(jié)果表明，Pak-1的陽性表達率在胃癌組、腸化生組、CNAG組、癌旁組中呈下降趨勢，且胃癌組中Pak-1的陽性表達率明顯高于癌旁組，這與李清[11]的研究結(jié)果一致。同時，腸化生組陽性表達率又明顯高于CNAG組和癌旁組，而CNAG組與癌旁組無明顯差異。提示Pak-1表達上調(diào)可能在胃黏膜炎癥向腸化生和惡性轉(zhuǎn)化中扮演重要角色，說明Pak-1蛋白表達是一個胃黏膜癌變的早期分子事件。

目前關(guān)于caspase-7在胃組織中的研究較少，其可能通過線粒體/細胞色素C通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路這三種方式誘導細胞凋亡[12]。本實驗結(jié)果表明，caspase-7的陽性表達率在胃癌組、腸化生組、CNAG組和癌旁組中呈升高趨勢，且胃癌組中caspase-7陽性表達率明顯低于腸化生組、CNAG組和癌旁組，與楊彬等[13]的研究結(jié)果一致。同時，腸化生組陽性表達率又明顯低于CNAG組和癌旁組，而CANG組與癌旁組無明顯差異。提示caspase-7蛋白表達下調(diào)參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程。

本研究表明腸化生組livin、survivin、Pak-1的陽性表達率明顯高于CNAG組和癌旁組，胃癌組又高于腸化生組，說明livin、survivin、Pak-1異常表達發(fā)生于腸化生早期，阻斷其表達可能對胃癌的發(fā)生起有一定的抑制作用。后續(xù)實驗將對腸化生嚴重程度進行分級，同時增加異型增生組、低級別、高級別上皮內(nèi)瘤變組，并檢測Ki-67進行進一步研究。本研究還發(fā)現(xiàn)livin、survivin、Pak-1、caspase-7蛋白表達與胃癌組織分化程度、腫瘤TNM分期、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，提示上述蛋白表達強度可反映腫瘤的惡性程度與轉(zhuǎn)移程度，有可能成為評價胃癌發(fā)展和預后的參考指標之一，可能是有潛在價值的腫瘤標志物和腫瘤治療的新靶點。考慮2種及以上基因相互影響的具體作用機制尚不明確，為提供更多的參考依據(jù)以證明多基因之間存在協(xié)同作用，還需進一步在分子水平上進行研究。

綜上所述，livin、survivin、Pak-1和caspase-7可能成為胃腺癌臨床診斷、判斷療效和監(jiān)測預后的指標之一。