低氧誘導(dǎo)小鼠肺動(dòng)脈高壓藥物評(píng)價(jià)模型的建立*

袁天翊，陳迪，孫姝嬋，方蓮花，杜冠華

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所1.天然藥物活性物質(zhì)與功能?chē)?guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension，PH)是肺動(dòng)脈壓力進(jìn)行性升高超過(guò)一定界值的病理生理狀態(tài)，該病主要由肺動(dòng)脈血管重塑所致，可導(dǎo)致右心衰竭，具有較高致死率[1]。目前國(guó)際上將PH分為5大類(lèi)，其中缺氧/肺部疾病所致肺動(dòng)脈高壓(hypoxia-associated PH，HPH)越來(lái)越受到重視[2]。

目前制備HPH模型通常將大鼠或小鼠置低氧艙，使其處于低氧狀態(tài)。由于嚙齒類(lèi)動(dòng)物與人差異較大，在低氧環(huán)境下往往產(chǎn)生較強(qiáng)代償，主要體現(xiàn)在肺新生血管大量形成，因此單純低氧往往不會(huì)引起動(dòng)物發(fā)生嚴(yán)重PH，也較難觀察到右心室重構(gòu)。SU5416是血管生長(zhǎng)因子受體抑制劑，低氧時(shí)使用該化合物，可以抑制動(dòng)物肺部血管新生，建立更嚴(yán)重的HPH模型[3]。雖然HPH造模方法比較明確，但動(dòng)物種屬、造模時(shí)間及檢測(cè)指標(biāo)在不同文獻(xiàn)中差異較大。為更全面地評(píng)價(jià)HPH造模方法，筆者在本研究檢測(cè)不同條件及不同造模時(shí)間下動(dòng)物模型生理生化指標(biāo)，評(píng)價(jià)不同條件下模型差異，以期為藥物評(píng)價(jià)不同階段選擇HPH模型提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)雄性C57小鼠，體質(zhì)量約20 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006，飼養(yǎng)環(huán)境溫度(25±1) ℃，相對(duì)濕度(55±2)%，每天光/暗交替12 h/12 h。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，批文編號(hào)00000945。

1.2藥物與試劑 SU5416[美國(guó)MCE公司，純度：99.96%，使用時(shí)將SU5416用二甲亞砜(DMSO，5%)+PEG300(40%)+聚山梨酯80(Tween80，5%)+超純水(50%)混合溶劑配制成1 mg·mL-1溶液，按0.2 mL·(10 g)-1即20 mg·kg-1皮下注射給予小鼠]；西地那非[美國(guó)Selleck公司，純度：99.5%，以0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液配制成5 mg·mL-1混懸液，按0.2 mL·(10 g)-1即100 mg·kg-1灌胃給予小鼠]；白細(xì)胞介素6(IL-6)、IL-1β、腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法檢測(cè)試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3儀器 BL420S生物機(jī)能試驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；Millar微型壓力導(dǎo)管(美國(guó)MILLAR公司)；高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司，Allegra X-22R)；SpectraMaxM5酶標(biāo)儀(美國(guó)MolecularDevices公司)；Attendor 140 Pro低氧艙(廣州華粵行公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與造模 取C57小鼠55只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，按隨機(jī)數(shù)字表法分為11組，每組5只：正常對(duì)照組(3個(gè)亞組：實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)分別為2，3，4周)、低氧組(3個(gè)亞組：實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)分別為2，3，4周)、低氧+SU5416組(3個(gè)亞組：實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)分別為2，3，4周)、低氧+西地那非組(實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)為4周)、低氧+SU5416+西地那非組(實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)為4周)。小鼠自由進(jìn)食進(jìn)水，正常組置于常氧環(huán)境飼養(yǎng)，每天灌胃給予等體積5% CMC-Na，每周皮下注射等體積混合溶劑；其他組小鼠置低氧艙，氧含量10%，艙內(nèi)二氧化碳(CO2)由CO2吸附劑清除。低氧+SU5416組及低氧+SU5416+西地那非組皮下注射SU5416，20 mg·kg-1，每周1次；低氧+西地那非組、低氧+SU5416+西地那非組灌胃給予西地那非，100 mg·kg-1，每日1次。監(jiān)測(cè)小鼠體質(zhì)量及死亡情況，以2，3，4周為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，檢測(cè)小鼠各項(xiàng)指標(biāo)。

1.4機(jī)能檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第2，3，4周，小鼠腹腔注射三溴乙醇(400 mg·kg-1)麻醉，固定，Ⅱ?qū)?lián)法檢測(cè)心電圖，右心導(dǎo)管插管檢測(cè)右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure，RVSP)，左頸動(dòng)脈插管檢測(cè)體循環(huán)壓力收縮壓(systolic blood pressure，SBP)和舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)。

1.5支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)檢測(cè) 分離小鼠氣管，預(yù)冷無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液0.3 mL進(jìn)行肺氣管插管灌洗。重復(fù)3次，合并灌洗液，4 ℃、300×g離心5 min。收集上清液，用于炎癥因子檢測(cè)。ELISA法檢測(cè)BALF中IL-6、IL-1β與TNF-α含量，操作方法參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.6臟器指數(shù)檢測(cè) 取小鼠心、肝、脾、肺、腎，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，濾紙吸干水分，分析天平稱質(zhì)量，臟器指數(shù)(%)=臟器質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×100%。

沿心耳下緣將整個(gè)心室從心臟上剪下，沿心室間隔邊緣剪下右心室，稱量右心室(R)及左心室加室間隔(L+S)質(zhì)量，計(jì)算[R/(L+S)]，確定有無(wú)右心室肥厚。

1.7肺病理組織學(xué)觀察 0.9%氯化鈉溶液沖洗肺組織余血，濾紙吸干，剪下左肺下葉，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后連續(xù)切片，Masson染色，觀察血管重塑情況。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism7版軟件作圖，one-way ANOVA或two-way ANOVA進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1體質(zhì)量變化 結(jié)果見(jiàn)圖1。造模過(guò)程中無(wú)小鼠因PH所致右心衰竭死亡，低氧+西地那非組小鼠灌胃過(guò)程中意外死亡1只。與正常組比較，低氧組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯遲緩，低氧+SU5416組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)遲緩現(xiàn)象加重；低氧+西地那非組、低氧+SU5416+西地那非組體質(zhì)量下降更明顯，提示西地那非對(duì)該模型治療效果不明顯，小鼠生存質(zhì)量未改善，甚至產(chǎn)生一定毒副作用。

圖1 5組小鼠體質(zhì)量變化曲線Fig.1 Change curves of body weight in five groups of

2.2心電圖變化 結(jié)果見(jiàn)圖2。檢測(cè)小鼠心電圖，統(tǒng)計(jì)心率、P波、QRS波群、S波、峰峰值，結(jié)果各組間未見(jiàn)明顯差異。低氧2～3周對(duì)小鼠心電影響不明顯。2周時(shí)，低氧組小鼠P波有加深趨勢(shì)。P波加深可能預(yù)示右心室發(fā)生變化。

圖2 5組小鼠心電圖變化情況Fig.2 Changes of ECG in five groups of

2.3體循環(huán)壓力 結(jié)果見(jiàn)圖3。第2周、第3周、第4周實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)檢測(cè)小鼠循環(huán)壓力，低氧組第4周體循環(huán)壓力略有上升，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示低氧及低氧聯(lián)合SU5416建立PH小鼠模型，4周內(nèi)對(duì)小鼠體循環(huán)影響不大；超過(guò)4周，PH可能導(dǎo)致體循環(huán)壓力升高，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

圖3 5組小鼠不同時(shí)間收縮壓(SBP)與舒張壓(DBP)測(cè)定結(jié)果Fig 3 Results of systolic blood pressure (SBP) and diastolic blood pressure (DBP) at different times in five groups of

2.4右心室收縮壓 結(jié)果見(jiàn)圖4。以右心室收縮壓代替肺動(dòng)脈壓，低氧組小鼠2周時(shí)肺動(dòng)脈壓顯著升高，隨著時(shí)間推移，低氧組小鼠肺部血管由于代償性增生，第3，4周肺動(dòng)脈壓力呈下降趨勢(shì)；低氧+SU5416組小鼠肺動(dòng)脈壓隨時(shí)間推移呈現(xiàn)較穩(wěn)定的升高趨勢(shì)，提示SU5416可抑制肺血管生成。因此筆者認(rèn)為，在快速評(píng)價(jià)藥物防治HPH效果時(shí)，可選擇2周低氧模型。制備慢性HPH及觀察藥物對(duì)該疾病后期治療作用時(shí)，可選擇SU5416聯(lián)合低氧且造模時(shí)間≥4周的小鼠模型。

2.5臟器指數(shù)與右心肥厚情況

2.5.1心肝脾肺腎臟器指數(shù) 結(jié)果見(jiàn)圖5。與正常對(duì)照組比較，其他各組小鼠肝臟和腎臟未發(fā)生明顯變化。與正常對(duì)照組比較，低氧組2周時(shí)，小鼠心臟臟器指數(shù)明顯升高，但隨著時(shí)間推移這種現(xiàn)象基本消失。筆者推測(cè)，2周時(shí)低氧組小鼠肺血管開(kāi)始新生，該過(guò)程中心臟發(fā)生一過(guò)性前后負(fù)荷增大，心臟指數(shù)升高。

正常對(duì)照組小鼠脾指數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)有所降低。與正常對(duì)照組比較，低氧組小鼠脾指數(shù)下降更明顯；與低氧組比較，低氧+西地那非組小鼠脾指數(shù)升高。該現(xiàn)象具體原因尚需要進(jìn)一步研究。

低氧組在各時(shí)間點(diǎn)肺指數(shù)均顯著增加，由此推測(cè)低氧可導(dǎo)致小鼠肺水腫；低氧+SU5416組肺水腫情況加重。低氧+西地那非組及低氧+SU5416+西地那非組小鼠肺水腫未被明顯抑制。

2.5.2右心室指數(shù) 結(jié)果見(jiàn)圖6。隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)，各組小鼠右心室均呈現(xiàn)增厚趨勢(shì)，但低氧組右心重構(gòu)不顯著。第4周時(shí)低氧+SU5416組出現(xiàn)顯著右心室重構(gòu)現(xiàn)象，低氧+西地那非組和低氧+SU5416+西地那非組小鼠右心室重構(gòu)現(xiàn)象未減輕。

2.6炎癥因子 結(jié)果見(jiàn)圖7。低氧組、低氧+SU5416組小鼠肺部炎癥因子含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2周時(shí)低氧組IL-6、IL-1β有升高趨勢(shì)。選擇該條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可以檢測(cè)BALF中上述兩種炎癥因子，擴(kuò)大樣本量可能出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖7 5組小鼠不同時(shí)間BALF中炎癥因子含量測(cè)定結(jié)果Fig.7 Inflammatory factors content in BALF of five groups of mice at different

2.7肺部血管重構(gòu) 將小鼠肺組織固定，包埋，切片，Masson染色觀察肺組織尤其是肺動(dòng)脈血管病理變化，結(jié)果見(jiàn)圖8。與正常對(duì)照組比較，低氧組小鼠肺組織病理變化不明顯，未見(jiàn)血管增厚與重塑，可見(jiàn)膠原沉積；低氧+SU5416組小鼠肺血管增厚，伴膠原沉積，血管內(nèi)可見(jiàn)血栓形成；低氧+西地那非組、低氧+SU5416+西地那非組肺部病理狀態(tài)稍有改善。綜合分析認(rèn)為，SU5416可加重低氧導(dǎo)致的肺損傷及血管功能紊亂，但抑制新生血管生成對(duì)于低氧所致血管重塑無(wú)明顯促進(jìn)作用。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，4周內(nèi)的低氧實(shí)驗(yàn)，如研究方向重點(diǎn)不在右心室重構(gòu)，則不需要采用SU5416造模。

圖8 5組小鼠不同時(shí)間肺組織masson染色病理切片(×100)Fig.8 Masson staining of lung tissue in five groups of mice at different times(×100)

3 討論

近年來(lái)，由于呼吸系統(tǒng)疾病高發(fā)，且許多伴有肺動(dòng)脈壓力升高的呼吸系統(tǒng)疾病患者預(yù)后較差，因此HPH逐漸受到重視。HPH發(fā)病機(jī)制尚不清楚，也沒(méi)有針對(duì)該病的特效藥，因此研究者急需建立可靠的動(dòng)物模型并應(yīng)用于藥物發(fā)現(xiàn)與評(píng)價(jià)。

雖然目前采用低氧或低氧聯(lián)合SU5416建立低氧動(dòng)物模型的報(bào)道較多[4]，但本研究對(duì)建立模型過(guò)程中的各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行了細(xì)致探討，對(duì)該模型的應(yīng)用具有一定意義。

造模時(shí)間上，筆者選擇2，3，4周3個(gè)時(shí)間點(diǎn)作為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。以往文獻(xiàn)中，造模時(shí)間一般為4周。分析本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，小鼠進(jìn)入低氧艙后體質(zhì)量開(kāi)始下降，約16 d達(dá)最低點(diǎn)，隨后開(kāi)始反彈。說(shuō)明小鼠在低氧2周后開(kāi)始逐步適應(yīng)低氧環(huán)境。從其他檢測(cè)指標(biāo)，包括心電圖、右心室收縮壓、臟器指數(shù)等指標(biāo)看，2周是小鼠對(duì)低氧環(huán)境反應(yīng)最明顯的時(shí)間點(diǎn)，低氧2周后小鼠開(kāi)始出現(xiàn)代償和適應(yīng)。因此，在對(duì)藥效未知的化合物進(jìn)行初次評(píng)價(jià)時(shí)，或?qū)Χ喾N化合物進(jìn)行篩選時(shí)，造模時(shí)間可選擇2周，一方面可縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，節(jié)約成本；另一方面能迅速判斷藥效。此外，在藥效評(píng)價(jià)過(guò)程中，可以采用預(yù)防給藥方式，用2周單純低氧小鼠模型模擬突發(fā)性低氧所致機(jī)體障礙，觀察藥物是否對(duì)低氧所致機(jī)體損傷有預(yù)防作用。

①與正常對(duì)照組比較，P<0.01；②與正常對(duì)照組比較，P<0.05。圖4 5組小鼠不同時(shí)間右心室收縮壓測(cè)定結(jié)果①Compared with normal control group，P<0.01；②Compared with normal control group，P<0.05Fig.4 Results of right ventricular systolic blood pressure at different times in five groups of

①與正常對(duì)照組比較，P<0.01。圖5 5組小鼠不同時(shí)間臟器指數(shù)變化①Compared with normal control group，P<0.01.Fig.5 Changes of organs indexes in five groups of mice at different

①與正常對(duì)照組比較，P<0.05。圖6 5組小鼠富爾頓指數(shù)(右心室指數(shù))①Compared with normal control group，P<0.05.Fig 6 Fulton indexes (right ventricular indexes) of mice in five

單純低氧較難導(dǎo)致小鼠右心室重構(gòu)，更難導(dǎo)致心力衰竭。SU5416是血管新生抑制劑，能抑制低氧所致肺血管新生，即能抑制機(jī)體對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)過(guò)程[5-6]。小鼠低氧2，3周，是否給予SU5416對(duì)于模型的建立無(wú)顯著影響，但小鼠肺指數(shù)明顯增加，提示肺損傷加重。小鼠低氧且每周皮下注射給予一次SU5416，4周后可見(jiàn)較明顯右心室肥厚，說(shuō)明發(fā)生了右心室重構(gòu)。因此，如實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖怯^察藥物對(duì)右心室重構(gòu)的影響，造模時(shí)間需≥4周，并采用低氧聯(lián)合SU5416造模。此外，筆者在本實(shí)驗(yàn)還觀察到，給予SU5416的小鼠肺血管出現(xiàn)較明顯血栓斑塊，證明SU5416加重了低氧對(duì)肺血管的損傷，該損傷與臨床PH患者病理表現(xiàn)相近。在時(shí)間和經(jīng)費(fèi)允許的情況下，建議采用長(zhǎng)時(shí)間低氧聯(lián)合SU5416造模方法評(píng)價(jià)藥效及進(jìn)行機(jī)制研究。

筆者在本研究中定量檢測(cè)各組小鼠BALF炎癥因子，該檢測(cè)指標(biāo)在既往HPH研究中較少被涉及。炎癥在HPH中占重要地位，但炎癥發(fā)展進(jìn)程以及對(duì)疾病的影響目前仍不清楚[7]。本實(shí)驗(yàn)中由于小鼠個(gè)體差異較大，各組間未顯示出差異。但從趨勢(shì)看，小鼠造模2周后所產(chǎn)生的炎癥因子增加，隨后炎癥因子產(chǎn)生量與正常小鼠相比未見(jiàn)明顯變化。說(shuō)明低氧早期小鼠肺部發(fā)生炎癥反應(yīng)，隨著機(jī)體對(duì)低氧的適應(yīng)，該炎癥反應(yīng)逐漸降低。

本研究采用西地那非100 mg·kg-1作為陽(yáng)性藥，并未觀察到明顯藥效，部分檢測(cè)指標(biāo)甚至顯示西地那非對(duì)小鼠機(jī)體有損傷作用。目前在我國(guó)，西地那非用于治療PH尚未獲得臨床許可，但許多患者已開(kāi)始使用該藥控制疾病發(fā)展，并且部分健康人去高海拔等氧含量較低的地區(qū)之前會(huì)預(yù)防性服用該藥物[8]。本實(shí)驗(yàn)中，西地那非未顯示明顯效果，可能與給藥劑量及頻次有關(guān)。這提示應(yīng)用HPH動(dòng)物模型進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)，選擇西地那非作為陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，需慎重選擇給藥劑量和頻次[9-10]。

綜上所述，單純低氧2周可作為快速評(píng)價(jià)治療HPH藥物效果的首選模型，低氧聯(lián)合SU5416造模≥4周可作為長(zhǎng)期藥效評(píng)價(jià)模型，尤其適用于藥物對(duì)血管及心臟的作用機(jī)制研究。