肺腺癌腦轉移病理學特征及人類間變性淋巴瘤激酶和表皮生長因子受體診斷價值

李竹君 毛璐寧 熊佶 王鑫 盧韶華 劉穎

肺癌是世界范圍內發病率居第2位、死亡率居首位的惡性腫瘤，總體5年生存率僅22%［1］。其中，非小細胞肺癌（NSCLC）是最常見的病理類型，占肺癌總病例數的80%～85%［2］。造成肺癌高病死率的最主要原因是局部復發和遠隔轉移，其中遠隔轉移以腦轉移最常見。約7.4%的非小細胞肺癌患者初診時即已存在腦轉移，25%～30%的患者在疾病進展過程中發生腦轉移［3］。隨著現代影像學技術的不斷進步，非小細胞肺癌腦轉移檢出率逐年增高［4］，此類患者之預后差，未經治療患者的中位生存期（MST）僅1～2個月，即使予以治療，中位生存期也僅3～6個月［5-6］。肺癌特異性腦轉移的機制目前尚不明確，阻礙早期發現或阻斷腦轉移的治療，因此，積極尋找肺癌腦轉移高表達的生物學標志物，對肺癌腦轉移預警具有十分重要的臨床意義。近年來，檢測肺癌相關分子遺傳改變并進行分子靶向治療的個體化治療逐漸成為肺癌治療研究熱點。研究表明，人類棘皮動物微管相關蛋白樣4（EML4）和人類間變性淋巴瘤激酶（ALK）重排形成的融合基因EML4-ALK，以及表皮生長因子受體（EGFR）基因是肺癌發生發展的驅動基因［7-12］。目前，臨床應用上述驅動基因及信號轉導通路的相關靶向抑制劑如吉非替尼、厄洛替尼等藥物已顯示出較好的治療前景。此外，表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs）和ALK抑制劑均可透過血-腦屏障，有用于治療腦轉移瘤的可能。但由于組織標本獲取的局限性，ALK基因重排與EGFR基因突變在肺癌轉移特別是肺癌腦轉移中的可獲取資料有限，故肺癌腦轉移患者能否從靶向藥物治療中獲益尚需實驗數據的支持。基于此，本研究通過獲取非小細胞肺癌腦轉移標本，分析肺腺癌與腦轉移相關病理學特點及與肺腺癌免疫治療相關基因突變，以期指導肺腺癌腦轉移的靶向藥物治療，延長患者生存期。

資料與方法

一、臨床資料

1.納入與排除標準 （1）明確診斷為非小細胞肺癌。（2）影像學顯示腦部病灶，手術切除后經病理證實為肺腺癌腦轉移。（3）單發腦部轉移灶。（4）本研究經復旦大學道德倫理委員會審核批準（批號：2021-Y022），所有患者或其家屬均知情同意并簽署知情同意書。（5）排除術后病理證實為非轉移性肺腺癌、原發性腦腫瘤，以及腦部腫瘤細胞比例＜5%的患者。

2.一般資料 根據上述納入與排除標準，選擇2013年1月至2016年12月在復旦大學附屬華山醫院神經外科住院治療的單發非小細胞肺癌腦轉移患者共86例，男性54例，女性32例；年齡29～82歲，平均（56.74±11.04）歲；均行腦部病變切除術，術后收集腦組織標本。

二、研究方法

1.病理學檢查 按照規范的手術標本程序制備腦組織切片［13］，經體積分數為4%的中性甲醛溶液固定、常規脫水、石蠟包埋，制備10μm層厚腦組織切片，分別行HE染色和免疫組化染色。免疫組化染色采用EnVision二步法，檢測用抗體包括P40（濟南邁新生物科技有限公司，1∶200）、甲狀腺轉錄因子-1（TTF-1，丹麥Dako公司，1∶100）、Napsin A（德國Leica公司，1∶200）、CD56（丹麥Dako公司，1∶100）、嗜鉻素A（CgA，丹麥Dako公司，1∶200）及突觸素（Syn，丹麥Dako公司，1∶500）；同時采用Leica BOND-MAX自動免疫組織化學機（德國Leica公司）對腦組織切片行ALK（濟南邁新生物科技有限公司）、EGFR（德國Leica公司）及EGFR基因外顯子19、21特異性突變抗體E746-A750del、L858R（美國Cell Signaling Technology公司，均1∶100）免疫組化染色，結果判讀以胞質內出現棕黃色顆粒為陽性。

2.病理分型 由兩位病理學專家依據2015年世界衛生組織（WHO）肺癌病理分類標準［14］，根據組織學形態特點加以必要的免疫組化標志物區分腺癌、鱗癌及內分泌癌。明確肺腺癌腦轉移后觀察其病理學特點，依據2011年國際肺癌研究協會（IASLC）/美國胸科學會（ATS）/歐洲呼吸學會（ERS）肺腫瘤組織學分類標準［15］，分析肺腺癌中腺泡型、實體型、乳頭型和微乳頭型所占比例，并按照主要成分分組。

3.統計分析方法 采用SPSS 22.0統計軟件進行數據處理與分析。計數資料以相對數構成比（%）或率（%）表示，采用χ2檢驗或配對χ2檢驗。以P≤0.05為差異具有統計學意義。

結 果

經HE染色及免疫組化染色證實，86例非小細胞肺癌腦轉移患者中74例（86.05%）為肺腺癌（圖1），3例（3.49%）為肺鱗癌（圖2），9例（10.47%）為肺神經內分泌腫瘤（圖3）。

圖1 低分化肺腺癌腦轉移病理學檢查所見 ×100 1a 腫瘤細胞呈彌漫性分布 HE染色 1b 腫瘤細胞胞核可見清晰的棕黃色顆粒，TTF-1呈強陽性 免疫組化染色（EnVision二步法） 1c 腫瘤細胞胞質可見清晰的棕黃色顆粒，Napsin A呈陽性 免疫組化染色（EnVision二步法） 1d 腫瘤細胞胞核不表達P40 免疫組化染色（EnVision二步法）Figure 1 Pathological observation of brain metastases from poorly differentiated lung adenocarcinoma ×100 The tumor cells were diffuse(Panel 1a). HE staining Clear brown-yellow particles could be seen in the nucleus of tumor cells,TTF-1 was strong positive expression(Panel 1b). Immunohistochemical staining(EnVision) Clear brown-yellow particles could be seen in the cytoplasm of tumor cells,Napsin A was positive expression(Panel 1c). Immunohistochemical staining(EnVision) No staining of tumor cell nucleus,P40 was negative expression(Panel 1d). Immunohistochemical staining(EnVision)

圖2 低分化肺鱗癌腦轉移病理學檢查所見 ×100 2a 腫瘤細胞呈巢狀分布 HE染色 2b 腫瘤細胞胞核不表達TTF-1 免疫組化染色（EnVision二步法） 2c 腫瘤細胞胞質不表達Napsin A 免疫組化染色（EnVision二步法） 2d 腫瘤細胞胞核可見清晰的棕黃色顆粒，P40呈強陽性 免疫組化染色（EnVision二步法）Figure 2 Pathological observation of brain metastasis from poorly differentiated lung squamous cell carcinoma ×100 The tumor cells distributed like nest(Panel 2a). HE staining No staining of tumor cell nucleus,TTF-1 was negative expression(Panel 2b).Immunohistochemical staining(EnVision) No staining of tumor cell cytoplasm,Napsin A was negative expression (Panel 2c).Immunohistochemical staining(EnVision) Clear brown-yellow particles could be seen in the nucleus of tumor cells,P40 was strong positive expression(Panel 2d). Immunohistochemical staining(EnVision)

圖3 低分化肺神經內分泌腫瘤腦轉移病理學檢查所見 ×100 3a 腫瘤細胞呈彌漫性散在分布 HE染色 3b 腫瘤細胞胞質可見清晰的棕黃色顆粒，Syn呈陽性 免疫組化染色（EnVision二步法） 3c 腫瘤細胞胞質可見清晰的棕黃色顆粒，CgA呈陽性免疫組化染色（EnVision二步法） 3d 腫瘤細胞胞核可見清晰的棕黃色顆粒，CD56呈強陽性 免疫組化染色（EnVision二步法）Figur e 3 Pathological observation of brain metastasis from poorly differentiated lung neuroendocrine carcinoma ×100 The tumor cells were diffuse(Panel 3a). HE staining Clear brown-yellow particles could be seen in the cytoplasm of tumor cells,Syn was positive expression(Panel 3b). Immunohistochemical staining(EnVision) Clear brown-yellow particles could be seen in the cytoplasm of tumor cells,CgA was positive expression(Panel 3c). Immunohistochemical staining(EnVision) Clear brown-yellow particles could be seen in the nucleus of tumor cells,CD56 was strong positive expression(Panel 3d). Immunohistochemical staining(EnVision)

根據組織學形態，74例肺腺癌腦轉移患者的病理分型以實體型為主要成分者最多，為44例（59.46%），其次為乳頭型14例（18.92%），腺泡型和微乳頭型分別為9例（12.16%）和7例（9.46%），無附壁型病例（圖4）。Lu等［16］回顧分析269例原發性肺腺癌患者的病理學特點，其病理分型以腺泡型為主要成分者最多，為139例（63.76%），其次為乳頭型53例（24.31%），實體型和微乳頭型分別為23例（10.55%）和3例（1.38%），余51例（18.96%）為附壁型，其中218例（81.04%）發生腦轉移。與本研究肺腺癌腦轉移的病理分型相比較，總體差異具有統計學意義（P=0.000，表1）。

表1 文獻報道的原發性肺腺癌與本研究肺腺癌腦轉移病理分型的比較［例（%）］Table 1. Comparison of the pathological classification of primary lung adenocarcinoma reported in the literature and the brain metastasis from lung adenocarcinoma in this study[case(%)]

圖4 肺腺癌腦轉移的病理分型 HE染色 ×200 4a 腺泡型：腫瘤細胞呈腺樣排列，胞質和腺腔內可見黏液 4b 實體型：多角形腫瘤細胞呈片狀排列 4c 乳頭型：腫瘤細胞圍繞纖維血管軸心呈乳頭狀排列 4d 微乳頭型：腫瘤細胞排列為缺少纖維血管軸心的簇狀Figure 4 Histological classification of brain metastases from lung adenocarcinoma HE staining ×200 Acinar type:the tumor cells were arranged in adenoids,the cytoplasm and glandular cavity contained mucus (Panel 4a). Solid type:polygonal tumor cells were arranged in sheets(Panel 4b).Papillary type:tumor cells were arranged in a papillary shape around the axis of fibrous vessels(Panel 4c).Micropapillary type:tumor cells were arranged in clusters lacking the axis of fibrous vessels(Panel 4d).

免疫組化顯示，74例肺腺癌腦轉移患者ALK呈現陰性、弱陽性、中陽性或強陽性（圖5），陽性率為9.46%（7/74），不同病理分型中ALK表達差異無統計學意義（P=0.639），其中微乳頭型不表達ALK；EGFR亦呈現陰性、弱陽性、中陽性或強陽性（圖6），陽性率為52.70%（39/74），不同病理分型中EGFR表達差異有統計學意義（P=0.047）；突變型EGFR檢測發現，EGFR-19（EGFR基因外顯子19特異性突變蛋白）陽性率為18.92%（14/74），EGFR-21（EGFR基因外顯子21特異性突變蛋白）陽性率為16.22%（12/74），突變型EGFR總體陽性率為33.78%（25/74，其中1例存在雙位點突變；圖7），不同病理分型中突變型EGFR表達差異無統計學意義（P=0.632，表2）。采用配對χ2檢驗對ALK與EGFR表達進行比較，差異有統計學意義（P=0.001，表3），提示肺腺癌腦轉移ALK與EGFR的表達可能相互排斥。

表2 肺腺癌腦轉移不同病理分型ALK、EGFR和突變型EGFR陽性率的比較Table 2. Comparison of the positive rate of ALK,EGFR and mutant EGFR in different pathological types of brain metastasis from lung adenocarcinoma

表3 肺腺癌腦轉移ALK與EGFR表達的差異［例（%）］Table 3. The difference of ALK and EGFR expression in brain metastases from lung adenocarcinoma[case(%)]

圖5 ALK免疫組化染色（EnVision二步法）所見 ×100 5a 腫瘤細胞胞質不表達ALK 5b 腫瘤細胞胞質ALK呈弱陽性 5c腫瘤細胞胞質ALK呈中陽性 5d 腫瘤細胞胞質ALK呈強陽性Figure 5 Immunohistochemically labeled ALK findings(EnVision) ×100 ALK expression was negative in cytoplasm of tumor cells(Panel 5a).ALK expression was weakly positive in cytoplasm of tumor cells(Panel 5b).ALK expression was moderately positive in cytoplasm of tumor cells(Panel 5c).ALK expression was strongly positive in cytoplasm of tumor cells(Panel 5d).

圖6 EGFR免疫組化染色（EnVision二步法）所見 ×100 6a 腫瘤細胞胞質不表達EGFR 6b 腫瘤細胞胞質EGFR呈弱陽性6c 腫瘤細胞胞質EGFR呈中陽性 6d 腫瘤細胞胞質EGFR呈強陽性Figure 6 Immunohistochemically labeled EGFR findings(EnVision) ×100 EGFR expression was negative in cytoplasm of tumor cells(Panel 6a).EGFR expression was weakly positive in cytoplasm of tumor cells(Panel 6b).EGFR expression was moderately positive in cytoplasm of tumor cells(Panel 6c).EGFR expression was strongly positive in cytoplasm of tumor cells(Panel 6d).

圖7 EGFR-19特異性突變蛋白（E746-A750del）和EGFR-21特異性突變蛋白（L858R）免疫組化染色（EnVision二步法）所見 ×100 7a 腫瘤細胞胞質不表達E746-A750del 7b 腫瘤細胞胞質E746-A750del呈陽性 7c 腫瘤細胞胞質不表達L858R 7d腫瘤細胞胞質L858R呈陽性Figure 7 Immunohistochemically labeled EGFR exon 19 specific mutation(E746-A750del)and EGFR exon 21 specific mutation(L858R)findings(EnVision) ×100 E746-A750del expression was negative in cytoplasm of tumor cells(Panel 7a).E746-A750del expression was positive in cytoplasm of tumor cells(Panel 7b).L858R expression was negative in cytoplasm of tumor cells(Panel 7c).L858R expression was positive in cytoplasm of tumor cells(Panel 7d).

討 論

Yoshizawa等［17］發現，病理分型是肺腺癌患者無病生存率（DFS）的預測因素。腺泡型和乳頭型預后較好，5年無病生存率為54%～87%，實體型和微乳頭型預后最差且有較高的轉移可能，其中微乳頭型是肺腺癌腦轉移的重要危險因素［18-20］。研究顯示，微乳頭型肺腺癌在腫瘤轉移過程中僅與腦轉移相關，并未見其他臟器轉移率的增加，但其發生高特異性腦轉移的原因尚不清楚［21］。Casteillo等［22］發現，腦轉移肺腺癌患者中腺泡型患者的總生存期為（26.5±6.3）個月、乳頭型為（30.1±5.6）個月，而實體型和微乳頭型患者的總生存期明顯縮短，分別為（13.8±1.4）和（11.6±10.1）個月，提示病理分型可以作為預測轉移性肺腺癌的重要因素。本研究結果顯示，肺腺癌腦轉移中以實體型為主要成分者最多，為44例（59.46%），其次為乳頭型14例（18.92%），提示這兩種病理分型可能在腫瘤侵襲和轉移過程中具有較強的侵襲行為，易發生腦轉移，應引起臨床醫師的高度重視。

2007年，Soda等［8］在非小細胞肺癌患者的腫瘤標本中首次發現EML4-ALK融合基因，其突變率約占非小細胞肺癌的5%［23］。國內學者的研究顯示，在非小細胞肺癌中，EML4-ALK融合基因的陽性率為4.2%［24］。文獻報道，肺腺癌中EML4-ALK融合基因的陽性率為10%［24-25］。有20%～35%的ALK陽性非小細胞肺癌患者發生腦轉移［26-27］。有研究采用免疫組化染色、熒光原位雜交（FISH）和逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）共3種檢測方法驗證EML4-ALK融合基因突變的檢測結果，具有較高的一致性［28］。本研究74例肺腺癌腦轉移患者，ALK陽性率為9.46%（7/74）。EML4-ALK融合基因陽性的肺腺癌具有獨特的病理學特點，常表現為腺泡樣生長方式伴細胞外黏液或以實性結構為主，含印戒細胞成分［29-30］，而本研究腦組織標本中并無腺泡樣伴細胞外黏液型。

EGFR基因是另一與肺癌發生發展密切相關的重要驅動基因。EGFR是一種跨膜糖蛋白，屬于酪氨酸激酶型受體，是ErbB家族成員，EGFR基因酪氨酸激酶區域體細胞之突變主要發生于外顯子18～21［31］。研究顯示，50%～80%的非小細胞肺癌患者存在EGFR基因過表達，亞洲人群肺腺癌EGFR基因突變率為51.4%［32］。目前檢測EGFR基因突變的主要方法有直接測序法和RT-PCR法，但繁瑣、耗時長、費用高。隨著EGFR基因經典突變特異性抗體的出現，傳統的免疫組化染色也可成為可能的檢測方法，且可以彌補上述缺陷，還具有快速、簡便、經濟等特點。研究業已證實，EGFR免疫組化染色結果與RT-PCR法結果具有高度一致性［33-35］。本研究結果顯示，74例肺腺癌腦轉移患者中突變型EGFR總體陽性率為33.78%（25/74），EGFR-19陽性率為18.92%（14/74）、EGFR-21陽性率為16.22%（12/74），且在不同病理分型中的表達無差別，因此認為，肺腺癌腦轉移的機制與EGFR基因突變無關。肺腺癌的基因突變與病理分型密切相關，有研究顯示，EML4-ALK融合基因突變與印戒細胞成分呈正相關關系［36-37］。此外，以附壁型為主的肺腺癌具有更高的EGFR突變率（47%～78%），而浸潤性黏液型肺腺癌EGFR突變率較低（0～22%）［38-39］。本研究結果顯示，肺腺癌腦轉移不同病理分型EGFR陽性率差異有統計學意義，但突變型EGFR（包括EGFR-19和EGFR-21）陽性率差異無統計學意義，推測可能與本研究樣本量較小有關，提示以微乳頭型和腺泡型為

主的晚期肺腺癌腦轉移患者可應用EGFR抑制劑。

近年研究顯示，EML4-ALK融合基因陽性的肺腺癌患者雖然與EGFR基因突變的肺腺癌患者之間具有某些相似的臨床特征，但大多數情況下，二者并不共存［40］，其中EML4-ALK融合基因突變多發生于較年輕患者和晚期患者［36］，進一步揭示肺腺癌多個基因突變存在互相排斥的現象。隨著對ALK基因的深入研究，發現有極少數患者有兩種突變共存現象［41］，本研究也存在4.05%（3/74）患者ALK/EGFR共表達，進一步采用配對χ2檢驗對ALK與EGFR的表達進行比較，差異具有統計學意義，推測二者的表達可能相互排斥,且突變型EGFR陽性率（33.78%）高于ALK（9.46%），即EGFR基因較ALK基因更易發生突變。不論是肺組織還是腦組織，ALK基因突變與EGFR基因突變存在相互排斥的根本原因究竟是同一分子事件的必然結果，還是不同分子事件的巧合？尚待在更廣泛的人群中進行檢測，并尋找更多分子生物學標志物，以揭示其本質和彼此之間的關聯性。

綜上所述，肺腺癌腦轉移患者的病理分型存在明顯差異，實體型、微乳頭型肺腺癌易發生腦轉移。因此，在臨床診斷與治療時應注意對具有較強侵襲行為、易發生早期轉移的以實體型和微乳頭型為主要成分的肺腺癌患者的隨訪，病理學醫師也應在肺癌常規報告中特別注意提示其病理分型。本研究74例肺腺癌腦轉移患者ALK和EGFR的陽性率分別為9.46%和33.78%，與原發性肺腺癌患者的陽性率相一致，且EGFR基因較ALK基因更易突變。期望上述觀察結果能夠為臨床醫師對肺癌腦轉移患者進行靶向藥物治療時提供一定的理論依據。

利益沖突 無