基于ITS2序列的竹葉花椒及其近緣種藥材鑒別△

齊景梁，高必興，2，茍琰，2，耿昭，卿艷，周娟，姜衛東*

1.四川省藥品檢驗研究院/國家藥品監督管理局 中成藥質量評價重點實驗室，四川 成都 611731；2.成都中醫藥大學，四川 成都 611137

除歷版《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)收載的花椒品種外，蕓香科花椒屬植物竹葉花椒ZanthoxylumarmatumDC.是收載標準最多的花椒屬藥材，藥用部位多為果皮，具有溫中止痛、殺蟲止癢之功效[1-4]。其主要分布于我國西南、華南、華東和華中地區[5]，川渝地區多有栽培。竹葉花椒具有較長的藥用歷史，《證類本草》《本草綱目》《植物名實圖考》等均有記載[6-8]。竹葉花椒又被稱作“青花椒”“藤椒”，常與《中國藥典》2020年版收載的花椒來源之一青花椒Z.schinifoliumSieb.et Zucc.相混淆(花椒的另一來源為花椒Z.bungeanumMaxim.)[9-10]。《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》2003年版野花椒(山花椒)品種項下除竹葉花椒外還收載了野花椒Z.simulansHance[1]。以上3種植物均為花椒屬植物，其果皮與竹葉花椒相近，不易區分。

作為中藥分子鑒定學上的創新，DNA條形碼技術可為動植物來源中藥材的鑒定提供快捷方法[11]。自Hebert等[12]于2003年首次正式提出DNA條形碼的概念以來，DNA條形碼技術發展迅速。《中國藥典》2020年版收載了中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導原則[13]。陳士林團隊[14-15]通過比較研究多個候選DNA條形碼序列，提出將內轉錄間隔區2(ITS2)作為藥用植物鑒定的標準DNA條形碼。目前，關于竹葉花椒的研究多集中于化學成分、藥理作用等方面，而分子生物學方面的研究多以花椒為重點。本研究選取ITS2序列，對竹葉花椒及其近緣種進行鑒別，從分子生物學角度區分竹葉花椒及其近緣種，為合理開發竹葉花椒提供參考。

1 材料

C1000型聚合酶鏈式反應(PCR)儀、PowerPac Basic型電泳儀、Gel Doc XR+型全自動凝膠成像系統(Bio-Rad公司)；XP205型電子分析天平(Mettler Toledo公司)；MM400型球磨儀(Retsch公司)；MiniSpin型高速離心機(Eppendorf公司)；Milli-Q Advantage A10型純水儀(Millipore公司)；植物基因組DNA提取試劑盒、2×M5 HiPer plusTaqHiFi PCR Mix、Gene Red核酸染料(天根生化科技有限公司)；Taq酶PCR擴增試劑盒(北京聚合美生物科技有限公司)；瓊脂糖(Biowest公司)；ITS2引物(ITS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′；ITS3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′)由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

從四川、重慶、寧夏、安徽、遼寧等地收集了13批竹葉花椒、4批花椒、4批青花椒藥材，均經四川省藥品檢驗研究院黎躍成主任中藥師進行性狀鑒定，分別為竹葉花椒ZanthoxylumarmatumDC.、花椒Z.bungeanumMaxim.、青花椒Z.schinifoliumSieb.et Zucc.的干燥成熟果皮，標本保存于四川省藥品檢驗研究院標本館。另從GenBank數據庫下載22條ITS2序列(5條竹葉花椒、7條花椒、5條青花椒、5條野花椒)用于比較分析。樣品信息見表1，GenBank下載序列信息見表2。

表1 花椒屬藥材樣品信息

表2 花椒屬藥材樣品GenBank下載序列信息

2 方法

2.1 提取DNA

依次用75%乙醇1 mL、滅菌超純水1 mL清洗樣品表面，晾干水分，用球磨儀研磨成粉末；取粉末約30 mg，按照DNA提取試劑盒說明書進行操作，提取DNA，-20 ℃保存備用。

2.2 PCR擴增及測序

擴增所用引物為通用引物[16]，擴增條件及參數參照文獻[16-17]方法及擴增試劑盒的說明。PCR反應體系為25 μL，包含2×TaqMasterMix緩沖液12.5 μL、上下游引物各0.6 μL、DNA模板1 μL，加滅菌超純水至25 μL。陰性對照為無模板DNA的反應體系。以10 000 r·min-1離心(離心半徑為3 cm)5 s后，置于PCR儀中。反應程序為95 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，35個循環；72 ℃延伸5 min。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測以確定目的條帶片段大小，擴增產物送Thermo Fisher公司進行測序。

2.3 數據分析

應用Codon Code Aligner V7.0.1對測序獲得的數據進行校對拼接，去除引物及低質量區，基于隱馬爾科夫模型的Hmmer注釋方法去除5.8S和28S區段，即可獲得ITS2序列信息[18]。

分別進入美國國家生物技術信息中心(NCBI，https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和中藥材DNA條形碼鑒定系統(http：//barcode.ndctcm.org/china/)，應用相似性搜索法對實驗樣品的不同單倍型序列進行Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)鑒定分析。

采用MEGA 7.0軟件對ITS2序列進行比對，計算種內、種間Kimura 2-parameter(K2P)遺傳距離，利用鄰接法(NJ)構建系統聚類樹，同時以Bootstrap自展支持率(1000次)重復檢驗各分支的支持率[19-20]。

登錄Internal Transcribed Spacer 2 Ribosomal RNA Database(http：//its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/)，對不同物種的主導單倍型進行ITS2二級結構的預測[21-23]，并采用Pseudoviewer(http：//pseudoviewer. inha.ac.kr/WSPV_quickSender.asp?)查看預測所得二級結構。

3 結果與分析

3.1 ITS2序列分析

不同來源的18條竹葉花椒ITS2序列比對后長度為227～228 bp，鳥嘌呤和胞嘧啶(GC)占比為70.0%～70.9%，種內變異位點6個，分別為68位點的C-T變異、96位點的C-T變異、125位點的A-T變異、167位點的C-T變異、180位點的C-T變異、181位點的C-T變異，形成5個單倍型。主導單倍型A1有9條序列，其中實驗樣品單倍型為A1～A3。不同來源的11條花椒ITS2序列比對后長度為223～224 bp，GC占比為66.1%～67.3%，種內變異位點10個，形成5個單倍型，主導單倍型B1有7條序列，其中實驗樣品單倍型為B1、B2、B4、B5。不同來源的9條青花椒ITS2序列比對后長度為224 bp，GC占比為71.0%，無種內變異位點，全為單倍型C1。5條野花椒ITS2序列比對后長度為224 bp，GC占比為68.8%，無種內變異位點，全為單倍型D1。竹葉花椒與其近緣種間的變異位點見圖1，種間變異程度較為豐富。

圖1 竹葉花椒及其近緣種ITS2序列的種內、種間變異位點

3.2 相似性搜索法分析

基于NCBI和中藥材DNA條形碼鑒定系統的BLAST鑒定結果見表3。BLAST結果與性狀鑒定結果一致。

表3 竹葉花椒及其近緣種BLAST鑒定結果

3.3 遺傳距離分析

竹葉花椒種內平均K2P遺傳距離為0.005，小于其與花椒(0.042)、青花椒(0.113)、野花椒(0.024)的種間平均K2P遺傳距離。竹葉花椒種內最大K2P遺傳距離(0.018)小于其與花椒的種間最小K2P遺傳距離(0.033)；小于其與青花椒的種間最小K2P遺傳距離(0.108)；接近其與野花椒的種間最小K2P遺傳距離(0.018)，見表4。

表4 竹葉花椒與其近緣種的種內、種間K2P遺傳距離

3.4 NJ系統聚類樹分析

從NJ系統聚類樹可以看出，各物種均能以大于50%的自展支持率各自聚為1支，表現出了良好的單系性。其中青花椒單獨聚為1支，與竹葉花椒、野花椒、花椒相區分，見圖2。

注：支上數值僅顯示自展支持率≥50%。圖2 基于ITS2序列構建的竹葉花椒及其近緣種的NJ樹

3.5 ITS2二級結構分析

在進行ITS2二級結構預測時，數據庫網站有與青花椒、野花椒主導單倍型相同的或高度相似的二級結構模型；竹葉花椒、花椒主導單倍型可直接生成二級結構。竹葉花椒及其近緣種ITS2二級結構見圖3。其二級結構均為典型的1環4臂結構，即1個大的多分支環和4個螺旋(helix)，每個螺旋上有數目不等的莖環，其中螺旋Ⅲ最長；基序(sequence motifs)為U-U mismatch (Ⅱ，left) U-U mismatch (Ⅱ，right) with AAA (btw.Ⅱ，Ⅲ) UGGU (Ⅲ，5′side)。竹葉花椒螺旋Ⅰ有3個凸環、1個發卡環；螺旋Ⅱ有2個內環、1個發卡環；螺旋Ⅲ有5個凸環、2個內環、1個發卡環；螺旋Ⅳ有3個凸環、1個發卡環。竹葉花椒近緣種可以從每個螺旋的長度、螺旋之間的反轉角度及螺旋上的莖環數目等方面與竹葉花椒進行區分。花椒、野花椒螺旋Ⅳ比竹葉花椒短，少1個莖環；青花椒螺旋Ⅲ比竹葉花椒多2個莖環；花椒、青花椒、野花椒螺旋Ⅰ與螺旋Ⅲ間的反轉角度與竹葉花椒均不相同。ITS2二級結構可以直觀地對竹葉花椒及其近緣種進行區分。

4 討論

中藥鑒定往往是多個方法的綜合運用和相互驗證。中藥材原植(動)物鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定的傳統方法存在一定局限性，而DNA條形碼技術不受個體形態特征和完整性的影響，方法易于統一、標準化，是傳統鑒定方法的有效補充[17，24]。但同時，DNA條形碼鑒定實驗取材極少，取樣誤差對實驗結果影響較大。加之市售中藥材情況較復雜，可能存在混雜甚至摻偽情況。因此，如何從量較大的中藥材中取樣，特別是從摻偽的樣品中取樣十分關鍵。這就需要借助性狀鑒別、顯微鑒別等手段對實驗樣品進行甄別，判斷樣品是否摻偽。若存在摻偽，就需分別進行取樣、實驗。本研究中的樣品均經過性狀鑒定，確定了樣品的單一性及其基原。最終ITS2條形碼鑒定結果與性狀鑒定結果一致。

與侯典云等[25]研究結果比較，本研究獲得了竹葉花椒、花椒ITS2序列的新單倍型；獲得的青椒單倍型與文獻中GU247238單倍型相同。但本研究中樣品批次及代表性仍有局限，各品種所獲得的單倍型還無法囊括自然界的所有單倍型。

花椒的最大種內遺傳距離為0.032，接近其與竹葉花椒的最小種間遺傳距離0.033；竹葉花椒最大種內遺傳距離為0.018，接近其與野花椒的最小種間遺傳距離0.018。花椒與竹葉花椒間、竹葉花椒與野花椒間不存在較寬的“barcoding gap”，即遺傳變異沒有形成明顯的間隔區。Meyer等[26]的研究也表明，理想的“barcoding gap”并不會經常出現。但通過比較種間平均遺傳距離，同時結合BLAST結果、NJ系統聚類樹及ITS2二級結構也可以對其進行區分。

注：A.竹葉花椒；B.花椒；C.青花椒；D.野花椒。圖3 竹葉花椒及其近緣種的ITS2二級結構

ITS2二級結構是由RNA中的核苷酸在氫鍵作用下發生堿基互補配對，導致自身回折形成的莖環結構，是實現細胞功能的結構基礎，包含著額外的系統發育信息[27-29]。因此，ITS2二級結構可以作為DNA條形碼鑒別中藥材的輔助手段。目前基于ITS2二級結構對中藥材進行的鑒別研究已見報道，如劉新星等[30]采用ITS2二級結構能將當歸與其混偽品和近緣屬藥材區分開，特別是在NJ聚類樹中獨活與當歸聚為一大支的情況下，通過分析兩者的ITS2二級結構能夠將其進行區分。高婷等[31]的研究表明，黃芪屬4個物種的ITS2二級結構在細節上存在差異。楊爍等[32]通過研究茄屬藥用植物的ITS2二級結構，表明ITS2二級結構可以提高鑒定效率。邵婧等[33]通過比較ITS2二級結構可以將茅蒼術與菊科近緣種藥材區分開來。本研究構建并比較了竹葉花椒及其近緣種藥材的ITS2二級結構，通過比較其莖環結構的細節差異可以將竹葉花椒及其近緣種進行區分。

通過K2P遺傳距離和NJ聚類樹可以看出，竹葉花椒、花椒、野花椒三者之間的遺傳關系較接近，而青花椒與三者間的遺傳關系較遠。這與植物形態分類學的觀點是一致的：竹葉花椒、花椒、野花椒同屬花椒亞屬(Subgen.Zanthoxylum)，而青花椒屬崖椒亞屬(Subgen.Fagara)。結果表明，DNA條形碼技術也可以為植物形態分類學服務。