UPLC波長切換法同時測定腦安顆粒中9種化學成分的含量及其化學模式識別分析

郭焱

鹽城市食品藥品監督檢驗中心，江蘇 鹽城 224000

腦安顆粒具有活血化瘀、益氣通絡的功效，主要用于腦血栓形成急性期、恢復期氣虛血瘀證候者的治療，該中藥復方制劑由川芎、當歸、紅花、人參、冰片5味中藥加工而成，收載于《國家藥品標準·新藥轉正》第34冊[1]。方中君藥川芎為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖，具有抑制血小板聚集、改善冠狀動脈血流量、抗缺血再灌注損傷、降低血管阻力等作用，與臣藥當歸同屬一科，兩者均以苯酞類為主的揮發油類成分為主要活性成分，具有相似的化學成分，還含有有機酸類、生物堿類等成分[2-4]。紅花為佐藥，其藥效成分羥基紅花黃色素A能有效改善患者神經功能缺損程度，促進急性腦梗死患者的康復[5-6]。《國家藥品標準·新藥轉正》第34冊采用薄層熒光掃描法對腦安顆粒中人參皂苷Re做定量測定，此方法操作煩瑣、誤差較大，且難以全面評價藥品質量。參考文獻[7]采用超高效液相色譜法(UPLC)測定腦安顆粒中的多種人參皂苷成分，但尚未有采用UPLC同時定量測定腦安顆粒中其他多種成分的文獻報道。為了全面評價腦安顆粒的質量，完善其質量評價標準，本研究采用UPLC波長切換法對其中洋川芎內酯 A、洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯H、川芎嗪、綠原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、藁本內酯、羥基紅花黃色素A 9種指標成分進行含量測定，為進一步的臨床研究提供參考。

1 材料

Waters ACQUITY型超高效液相色譜儀，包括真空脫氣機、二元泵、自動進樣器、柱溫箱、2998型二極管陣列檢測器、Empower 2.0工作站；AUW-220D型電子天平(d=0.01 mg，美國島津公司)；KQ-250DB型數控超聲波清洗器(昆山超聲波儀器有限公司，功率：500 W，頻率：50 kHz)。

對照品阿魏酸(批號：110773-201915，純度：99.4%)、綠原酸(批號：110753-201817，純度：96.8%)、鹽酸川芎嗪(批號：110817-201608，純度：83.4%)、藁本內酯(批號：111737-201910，純度：100.0%)、羥基紅花黃色素A(批號：111637-201810，純度：93.1%)均購自中國食品藥品檢定研究院；洋川芎內酯 A(批號：CHB170817)、洋川芎內酯Ⅰ(批號：CHB161125)、洋川芎內酯 H(批號：CHB171229)、阿魏酸松柏酯(批號：CHB170912)、川芎嗪(批號：CHB180627)均購于上海純優生物科技有限公司，純度均≥98.0%；甲醇、乙腈均為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

腦安顆粒購自藥店，共收集到3個廠家13個批次的樣品，規格：1.2 g/袋，產品信息見表1。

表1 13批腦安顆粒樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax Eclipse Plus C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動相：乙腈(A)-0.4%冰醋酸溶液(B)，梯度洗脫(0～12 min，5%～10%A；12～15 min，10%～38%A；15～22 min，38%～55%A；22～25 min，55%～5%A；流速：0.3 mL·min-1；檢測波長：0～8 min，285 nm(綠原酸、川芎嗪)；8～10 min，320 nm(阿魏酸)；10～12 min，304 nm(羥基紅花黃色素A)；12～19 min，285 nm(洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎內酯A)；19～25 min，320 nm(藁本內酯)[8-11]；柱溫：30 ℃；進樣量：2 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液的制備 精密稱取洋川芎內酯A、洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯H、川芎嗪、綠原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、羥基紅花黃色素A和藁本內酯對照品各適量，加55%甲醇超聲處理溶解后制成質量濃度分別為0.206 7、0.200 2、0.193 7、0.081 6、0.138 9、0.126 3、0.145 1、0.124 7、0.342 4 mg·mL-1的混合對照品儲備液，置冰箱冷藏避光保存，備用。

2.2.2供試品溶液的制備 取裝量差異項下的腦安顆粒，研勻，取約1.0 g，精密稱定，置50 mL棕色量瓶中，加入55%甲醇約30 mL，30 ℃超聲處理(功率：500 W，頻率：50 kHz)45 min，放冷至室溫，再用55%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液經0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液，冷藏避光保存。

2.2.3陰性供試品溶液的制備 按照腦安顆粒處方工藝分別制備缺川芎、當歸、紅花的陰性樣品，依照2.2.2項下供試品溶液制備方法處理，即得陰性供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1系統適用性試驗 分別精密吸取2.2項下的供試品溶液、混合對照品溶液、陰性供試品溶液、空白溶劑各2 μL，按2.1項下色譜條件測定，結果理論板數均大于9800，9種成分與相鄰色譜峰之間的分離度均大于1.5，拖尾因子均小于1.15，空白溶劑與陰性供試品溶液中的其他成分對9種成分的測定無干擾，說明該色譜系統專屬性較好。色譜圖見圖1。

注：A.混合對照品；B.樣品；C.缺川芎、當歸陰性樣品；D.缺紅花陰性樣品；1.綠原酸；2.川芎嗪；3.阿魏酸；4.羥基紅花黃色素A；5.洋川芎內酯Ⅰ；6.洋川芎內酯H；7.阿魏酸松柏酯；8.洋川芎內酯A；9.藁苯內酯。圖1 對照品、陰性樣品及腦安顆粒溶液UPLC圖

2.3.2線性關系考察 分別精密吸取2.2.1項下混合對照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，分別置20 mL量瓶中，加55%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，得系列混合對照品溶液。取上述系列混合對照品溶液和混合對照品儲備液，設置進樣體積為2 μL，按2.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖。以質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸，繪制各組分回歸曲線，計算相應回歸方程

和相關系數(r)。結果表明，洋川芎內酯A、洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯H、川芎嗪、綠原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、羥基紅花黃色素A和藁本內酯在實驗范圍內呈良好的線性關系。將對照品溶液逐級稀釋后，以信噪比S/N=10時的質量濃度為各成分的定量限(LOQ)，結果見表2。

表2 腦安顆粒9種有效成分的線性范圍

2.3.3精密度試驗 取混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖并計算9種成分峰面積的RSD。結果洋川芎內酯A、洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯H、川芎嗪、綠原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、羥基紅花黃色素A和藁本內酯峰面積RSD(n=6)分別為1.03%、0.86%、0.72%、0.65%、0.88%、0.91%、0.58%、1.11%、0.94%，表明儀器精密度良好。

2.3.4穩定性試驗 取同一供試品溶液(S4)，分別于制備后0、4、8、12、16、20、24 h按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖并計算9種成分峰面積的RSD。結果洋川芎內酯A、洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯H、川芎嗪、綠原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、羥基紅花黃色素A和藁本內酯峰面積的RSD(n=7)分別為1.08%、1.02%、0.79%、0.88%、0.91%、0.67%、0.83%、0.81%、0.98%，表明供試品溶液24 h內穩定性良好。

2.3.5重復性試驗 取同一批供試品(S4)6份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖及峰面積，按2.3.2項下回歸方程計算9種成分的含量及其RSD。結果洋川芎內酯A、洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯H、川芎嗪、綠原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、羥基紅花黃色素A和藁本內酯平均質量分數分別為0.297 8、0.261 3、0.258 8、0.110 9、0.361 7、0.302 1、0.215 4、0.197 2、1.115 3 mg·g-1，RSD(n=6)分別為1.07%、1.13%、0.98%、0.89%、1.01%、0.75%、0.85%、0.69%、0.93%，表明該方法重復性良好。

2.3.6加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的供試品(S4)6份，每份約0.5 g，精密稱定，分別精密加入洋川芎內酯A、洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯H、川芎嗪、綠原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、羥基紅花黃色素A和藁本內酯混合對照品溶液(質量濃度分別為101.3、89.2、87.3、37.53、123.2、103.4、74.13、67.27、117.07 μg·mL-1)1.50 mL，按2.2.2項下供試品溶液制備方法處理，按2.1項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，計算各成分加樣回收率及相應RSD。結果洋川芎內酯A、洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯H、川芎嗪、綠原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、羥基紅花黃色素A和藁本內酯平均加樣回收率及RSD分別為100.01%(RSD為0.75%)、99.57%(RSD為0.62%)、99.21%(RSD為0.53%)、99.35%(RSD為1.10%)、99.94%(RSD為0.65%)、99.84%(RSD為1.11%)、98.70%(RSD為0.56%)、99.59%(RSD為0.78%)、99.26%(RSD為1.03%)，結果見表3。

表3 腦安顆粒9種成分的加樣回收率試驗結果

續表3

2.4 樣品含量測定

取供試品13批，分別按照2.2.2項下條件制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件平行進樣3針，記錄色譜圖及峰面積，按2.3.2項下回歸方程計算9種活性成分含量，結果見表4。

表4 腦安顆粒中9種成分含量測定結果 mg·g-1

2.5 化學模式識別分析

將13批腦安顆粒含量測定結果輸入SPSS 22.0軟件和SIMCA 14.0軟件進行聚類分析和主成分分析。

2.5.1聚類分析 系統聚類分析是根據測定樣品的數據，將研究對象劃分為不同類別，類別內的研究對象有相似特點，類別間的對象則有所不同的一種多元統計分析方法[12-13]。利用 SPSS 22.0軟件，采用利差平方和法(Ward 法)，以歐式距離平方為樣品測度，對13批樣品進行聚類分析。分析發現，當歐式距離為5時，13批樣品被分成了3類：S1、S2、S3、S4、S5為第I類，S6、S7、S8、S9、S10為第Ⅱ類，S11、S12、S13為第Ⅲ類。第I類均為河南省百泉制藥有限公司產品，第Ⅱ類全部為上海祥鶴藥業有限公司產品，第Ⅲ類全部為遼源譽隆亞東藥業有限責任公司產品。說明同一廠家產品質量具有較高的穩定性，不同廠家的樣品之間存在一定差異。聚類分析樹狀圖見圖2。

圖2 13批腦安顆粒聚類分析樹狀圖

2.5.2主成分分析及藥物質量評價 以13批腦安顆粒中的9個成分含量為指標建立數據集，輸入SPSS 22.0軟件，運用因子分析中的主成分分析處理，提取累積方差貢獻率>85%的因子[14-18](A1、A2、A3)作為主成分，其中A1特征值為5.718，方差貢獻率為62.421%，A2特征值為1.469，方差貢獻率為16.327%，A3特征值為1.227，方差貢獻率為13.633%。3個主成分的相關系數矩陣及因子得分矩陣見表4～5。由表4可知，川芎嗪、綠原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯和藁本內酯之間均具有較大的正相關性。由表5因子得分矩陣可知，洋川芎內酯 Ⅰ、綠原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、藁本內酯對主成分A1貢獻較大，洋川芎內酯 A和洋川芎內酯 H對主成分A2貢獻較大，川芎嗪和羥基紅花黃色素A對主成分A3貢獻較大。

以每個主成分的特征值占累加特征值的百分比作為權重系數進行線性組合，可得到綜合得分計算公式(1)。

F=0.624F1+0.163F2+0.136F3

(1)

F代表綜合得分，F1、F2和F3分別代表3個主成得分，其中Fn=FACn×相應特征值的算術平方根(n代表1、2、3，FAC為主成分的因子得分系數)，結果見表6。綜合得分越高，說明以9個有效成分為指標的腦安顆粒質量越好。由表7可知，上海祥鶴藥業有限公司生產的產品質量較好。

表5 腦安顆粒中9種成分相關系數矩陣

表6 腦安顆粒中9種成分因子得分矩陣

表7 13批腦安顆粒主成分得分、綜合得分及排序

3 討論

3.1 方法學條件

研究過程中，采用二極管陣列檢測器(PAD)在190～400 nm全波長進行篩選；考察了不同比例和梯度的流動相系統(甲醇、乙腈、水、0.2%磷酸、0.4%冰醋酸、0.5%甲酸)對色譜峰的影響；對柱溫(25、30、35 ℃)、提取溶劑(甲醇、乙醇、75%甲醇、75%乙醇、55%甲醇、55%乙醇)、提取方式(超聲、浸漬過夜、回流)、提取時間(35、45、55 min)、超聲頻率及超聲功率都進行考察。通過上述研究，最終選擇分段變換波長檢測法對9種化學成分進行測定并優化得到了本研究所需的色譜條件。

3.2 液相色譜儀的考察

本實驗分別考察高效液相色譜儀和超高效液相色譜儀對腦安顆粒的分析，結果UPLC相較HPLC不僅大大縮短了分析時間(由80 min縮短到25 min)，而且各主要成分的分離效果更好，能滿足系統適用性試驗的要求，靈敏度和專屬性更強，測定結果準確、可靠。

3.3 聚類分析和主成分分析

主成分分析是對復雜信息的多維變量進行提取及數學降維，生成新的綜合變量的相互獨立的方法，生成的綜合變量即是主成分。主成分分析法在不損失大量信息的前提下，將高維數據轉換成低維數據，便于觀察藥物之間的差異性，特別適用于中藥多成分的綜合質量評價分析。本研究對13批腦安顆粒樣品中的9種成分含量測定數據進行聚類分析和主成分分析，兩者分析結果一致，13批樣品的9個成分含量存在一定差異，被分為3大類，可以很好識別不同生產廠家的樣品。

中藥復方制劑成分復雜，往往是多種藥效成分協同作用，故多組分含量同時測定更能客觀全面反映中藥制劑的質量。本研究建立UPLC同時測量腦安顆粒中的洋川芎內酯A、洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯H、川芎嗪、綠原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、羥基紅花黃色素A和藁本內酯9種成分的含量，與HPLC相比大大縮短了分析時間，且精密度、穩定性、重復性、加樣回收率均符合方法學要求，可為腦安顆粒藥品質量評價提供參考。