一測多評法同時測定鉤藤飲片中4種生物堿類化學成分△

范愷磊，王協和，杜俊潮，李松，張云天，陳盛君，*，陳可冀，彭軍，許運明

1.江陰天江藥業有限公司，江蘇 江陰 214434；2.江蘇省中藥配方顆粒制備與質量控制關鍵技術重點實驗室，江蘇 江陰 214434；3.江蘇省中藥配方顆粒工程技術中心，江蘇 江陰 214434；4.江蘇省中藥配方顆粒工程研究中心，江蘇 江陰 214434；5.福建中醫藥大學 中西醫結合研究院，福建 福州 350112

鉤藤原名釣藤，始載于《名醫別錄》，《中華人民共和國藥典》2015年版一部規定鉤藤來源于茜草科鉤藤屬植物鉤藤Uncariarhynchophylla(Miq.) Miq.ex Havil.、華鉤藤U.sinensis(Oliv.) Havil.、大葉鉤藤U.macrophyllaWall.、毛鉤藤U.hirsutaHavil.和無柄果鉤藤U.sessilifrutusRoxb.的帶鉤莖枝，主要分布于廣西、廣東、貴州、福建、江西等地[1]。鉤藤作為常用中藥，具有清熱平肝、息風止痙等功效[2]，現代常作為降壓藥配伍使用[3]，也具有神經保護[4]等功效。生物堿是鉤藤中主要活性成分，主要為吲哚生物堿和氧化吲哚生物堿。鉤藤中現今已發現的吲哚類生物堿成分有100多種[5]，有效成分為鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿和異去氫鉤藤堿等[6-7]。其中鉤藤堿占了總生物堿的28.9%，異鉤藤堿占了總生物堿的14.7%，兩者占了鉤藤總堿的40%以上[8]。因此，以鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿4種生物堿作為鉤藤質量控制主要指標具有一定合理性，但由于鉤藤中生物堿含量低、對照品獲得性較難、價格昂貴，不利于對鉤藤飲片進行質量控制。因此，本研究基于一測多評(QAMS)測定鉤藤中4種生物堿含量，對于鉤藤飲片的質量控制具有一定的現實意義。

1 材料

1.1 儀器

UPLC(美國沃特世公司)；UPLC(賽默飛世爾科技有限公司)；1260型HPLC儀(美國安捷倫公司)；KQ-250E型超聲清洗機(昆山超聲儀器有限公司)；ME204E型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；GKC型控溫水浴鍋(南通華泰實驗儀器有限公司)；Sartoris arium 611 DI型超純水機(德國賽多利斯公司)；乙腈(色譜純，ThermoFisher公司)；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.2 試藥

對照品鉤藤堿(批號：112028-201601，純度≥98%)、異鉤藤堿(批號：11927-201403，純度≥98%)購于中國食品藥品檢定研究院；對照品去氫鉤藤堿(批號：ST10570120MG，純度≥98.0%)、異去氫鉤藤堿(批號：ST11080120MG，純度≥98.0%)購于上海詩丹德生物技術有限公司。

12批鉤藤飲片均為產地調研收集樣品，經江陰天江藥業有限公司唐波教授鑒定為茜草科植物鉤藤的干燥帶鉤莖枝，其產地信息見表1。

表1 鉤藤樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Thermo Accucore C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，5 μm；100 mm×2.1 mm，2.6 μm)；以0.02%三乙胺溶液(2%磷酸調節pH至7.5～7.6)-乙腈(65∶35)為流動相；檢測波長為246 nm；柱溫為30 ℃；體積流量為0.4 mL·min-1；進樣量為1 μL；理論板數按異鉤藤堿峰計算應不低于8000。

2.2 混合對照品溶液的制備

取對照品鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿適量，精密稱定，加甲醇制成含鉤藤堿42.10 mg·mL-1、異鉤藤堿39.79 mg·mL-1、去氫鉤藤堿39.80 mg·mL-1、異去氫鉤藤堿40.92 mg·mL-1的混合溶液，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品粉末(過四號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，密塞，稱定質量，加熱回流45 min，取出，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 方法學驗證

2.4.1專屬性 分別精密吸取2.2項下的混合對照品溶液、2.3項下供試品溶液、陰性對照溶液甲醇，按2.1項下色譜條件進行測定，結果表明，空白溶劑色譜與對照品、供試品色譜相對應保留時間處均沒有相應的色譜峰，說明該方法對測定鉤藤飲片中的去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿、異鉤藤堿、鉤藤堿具有專屬性，無其他干擾，結果見圖1。

注：A.陰性對照溶液；B.混合對照品溶液；C.異去氫鉤藤堿對照溶液；D.去氫鉤藤堿對照品溶液；E.異鉤藤堿對照溶液；F.鉤藤堿對照溶液；G.鉤藤飲片供試品溶液。圖1 鉤藤飲片供試品溶液、陰性對照品溶液、4種生物堿類成分對照品溶液及混合對照品溶液的UPLC圖

2.4.2線性考察 分別精密量取混合對照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 μL，注入液相色譜儀，按2.1項下的色譜條件測定，以峰面積積分值為縱坐標(Y)，進樣量為橫坐標(X)，繪制標準曲線，求得回歸方程。結果表明，去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿、異鉤藤堿、鉤藤堿在相應的線性范圍內進樣量與峰面積值呈良好的線性關系，結果見表2。

表2 4種生物堿類成分的回歸方程、相關系數和線性范圍

2.4.3精密度試驗 精密吸取2.2項下混合對照品溶液注入液相色譜儀，按2.1項下色譜條件測定，連續進樣6次，記錄其峰面積測量值，計算RSD，結果表明，去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿、異鉤藤堿、鉤藤堿精密度RSD分別為0.16%、0.17%、0.19%、0.32%，說明儀器精密度良好。

2.4.4重復性試驗 取鉤藤飲片(編號：S3)平行6份，分別按2.3項下供試品溶液制備方法制成供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，記錄異去氫鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異鉤藤堿、鉤藤堿峰面積值，計算其平均含量及 RSD，結果表明，去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿、異鉤藤堿、鉤藤堿平均含量RSD分別為0.81%、1.70%、0.69%、1.99%，結果表明該方法重復性良好。

2.4.5穩定性試驗 取2.3項下的樣品(編號：S3)分別于0、1、2、4、8、12 h進樣，進樣1 μL，測定峰面積值，計算其RSD，測得去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿、異鉤藤堿、鉤藤堿峰面積的RSD分別為0.58%、0.79%、1.13%、1.42%，結果表明，所測定的4個生物堿類成分在12 h內穩定性較好。

2.4.6加樣回收率試驗 取鉤藤飲片(編號：S3)粉末約0.25 g，精密稱定，分別加入異去氫鉤藤堿(93.37 μg·mL-1)、去氫鉤藤堿(176.91 μg·mL-1)、異鉤藤堿(143.08 μg·mL-1)、鉤藤堿(71.16 μg·mL-1)對照品適量，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測得4種成分的加樣回收率，結果表明，去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿、異鉤藤堿、鉤藤堿加樣回收率均為95%～105%，RSD分別為1.33%、0.25%、0.93%、2.92%，結果表明該方法準確性良好。

2.5 相對校正因子(RCF)計算和相對保留時間(RRT)的確認

分別精密吸取2.2項下的混合對照品溶液，按2.1項下的色譜條件，在不同色譜柱、儀器、流速、柱溫條件下進行測定，記錄色譜圖，按QAMS建立的有關技術指南[9]，以異鉤藤堿為參照物，計算其他3種生物堿的RCF與RRT，結果見表3～6。

2.6 RCF驗證

取10批鉤藤飲片，按2.3項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下的色譜條件分別進行測定，以外標法、QAMS分別計算4種生物堿的含量，結果見表7。結果表明，2種計算方法結果接近，RSD<5%，說明QAMS所得含量準確可靠，該含量測定方法符合方法學要求，可替代外標法，用于鉤藤中鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿的含量測定，結果見表7。

表3 鉤藤相對校正因子與相對保留時間

表4 不同流速的相對校正因子與相對保留時間

表5 不同柱溫的相對校正因子與相對保留時間

表6 不同儀器的相對校正因子與相對保留時間

表7 鉤藤飲片供試品溶液中4種生物堿類成分一測多評法和外標法含量測定結果

3 討論

鉤藤中活性成分主要是生物堿，包括鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿等化學成分。鉤藤堿與異鉤藤堿，去氫鉤藤堿與異去氫鉤藤堿分別為一對同分異構體，均屬于吲哚型生物堿。由于結構接近，較難分離[10]。因此，在流動相的選擇中，本實驗嘗試用乙腈-水、甲醇-水，以封端處理的色譜柱進行分離，均不能將4種生物堿分開；當以少量三乙胺為掃尾劑時，峰形明顯改善，對稱性較好。考慮到三乙胺對色譜柱的影響，實驗中也嘗試用氨水代替三乙胺，發現4種生物堿也能達到基線分離，但峰形對稱性不及三乙胺。本研究中發現，pH對4種生物堿的分離也有一定影響，當pH為7.5～7.6，4種生物堿完全達到基線分離；當pH為7.7～7.9，異去氫鉤藤堿與異鉤藤堿峰逐漸靠近，分離度減小；當pH在7.5以下時，異去氫鉤藤堿與去氫鉤藤堿峰逐漸靠近，鉤藤堿與異鉤藤堿峰逐漸靠近，分離度減小。

目前研究發現，鉤藤飲片主要包括五環單帖吲哚型生物堿、四環單帖吲哚型生物堿等[11]，其中鉤藤堿與異鉤藤堿占有總生物堿的40%以上，異去氫鉤藤堿與去氫鉤藤堿含量也較高，具有較為明確的藥效。鉤藤在部分方劑中常要求“后下”，有研究表明，其原因可能是鉤藤生物堿不穩定所致，受熱易發生轉化，因此不宜久煎[12]。楊秀娟等[13]研究進一步發現，鉤藤中的生物堿在水提取液中60～80 ℃長時間加熱情況下穩定性較差，加熱過程中大部分鉤藤堿可以轉化為異鉤藤堿，而異鉤藤堿中一部分又可以轉化為去氫鉤藤堿與異去氫鉤藤堿。目前，中藥飲片質量標準制訂和質量控制思路往往更強調從中藥飲片自身原本含有的化學成分來開展相關化學成分分析檢測，而較少從中醫臨床用藥方式常為煎湯后服用的角度考慮，因此，難以發現煎煮過程中化學成分變化的規律性，而中藥飲片質量評價最終是要為臨床用藥安全性和有效性服務，有必要兼顧中藥飲片水煎煮過程中發生的化學物質轉化特點，更全面地反映中藥原料的質量。鉤藤僅以鉤藤堿為檢測指標，并不能很好地控制鉤藤及其制劑的質量，本研究選擇以去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿、鉤藤堿、異鉤藤堿含量代表鉤藤總生物堿含量，為鉤藤飲片的質量控制提供參考。