小鼠肝纖維化模型復制方法的研究進展*

王梓睿，田飛鴻，饒木艷，姚繼紅，李華，王麗

（大連醫科大學藥學院，遼寧大連116044）

肝纖維化指由于多種病因導致肝細胞發生變性、炎癥及壞死等，進而刺激肝細胞外基質合成與降解失調，造成肝臟內的纖維結締組織異常增生、沉積而引起的一系列病理、生理過程[1]。遺傳、代謝、炎癥、毒素、藥物及寄生蟲等各種刺激都可以引起肝臟纖維化[2]。但無論何種病因引起的肝損傷，其纖維化過程一致，即以肝星狀細胞的活化為主要特征。肝星狀細胞活化后獲得肌成纖維細胞表型，并在肝臟分泌、沉積大量細胞外基質[3-4]。當肝臟損傷持續時間較長，慢性炎癥刺激和細胞外基質的持續沉積會導致瘢痕組織替代正常肝臟組織，約30%肝纖維化患者逐漸發展為肝硬化甚至肝癌[4]。

闡明肝臟纖維化的發病機制，開發治療藥物，預防、治療甚至逆轉肝纖維化，一直是治療慢性肝臟損傷的核心環節。目前肝纖維化動物模型以多種嚙齒類動物為主[5]，考慮實驗動物成本和轉基因動物多為小鼠，因此越來越多肝纖維化研究用小鼠進行模型復制。根據引起肝纖維化的原因，可將小鼠肝纖維化模型分為以下幾種類型[5]，并將其優缺點綜述如下（見表1）。

表1 不同小鼠肝纖維化模型的優缺點比較

1 膽汁淤積致肝纖維化

1.1 膽總管結扎法

膽汁淤積是急慢性肝臟疾病引起肝臟纖維化及肝硬化的主要原因之一。膽總管結扎是復制膽道梗阻性膽汁淤積肝纖維化模型最常用的方法。將8～10 周小鼠麻醉，開腹后游離膽總管進行雙重結扎，并在兩處結扎線間離斷，以確保膽總管完全阻斷，之后手術線縫合，關閉腹腔[6-7]。膽總管結扎后小鼠進食量減少，皮毛散亂無光澤，行動變少且對外界刺激（如聲、光等）的反應減弱，尿液顏色加深，深紅帶黃，似濃茶樣改變。第15 天時，肝臟開始明顯改變，肝臟明顯腫大，谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶升至正常肝臟水平的10 倍以上，經HE 染色及天狼星紅染色后，膽總管結扎小鼠肝組織可見明顯改變：肝臟匯管區及膽管周圍肝細胞腫脹、破裂、空泡變性，炎癥細胞浸潤表現明顯，門靜脈周圍及竇周纖維化明顯[8]。膽總管結扎法復制小鼠肝纖維化模型，操作簡單，成模率高，肝臟纖維化明顯，指標穩定，短期內纖維化不會自行逆轉。實驗過程中要嚴格無菌操作，避免后期感染，必要時可在術中或術后給予少量抗菌藥物預防。膽總管結扎要熟練、扎實，以防手術線脫落，膽汁或腸內消化液流入腹腔，造成腹腔炎癥引起實驗動物死亡。

1.2 轉基因動物法

近年來，隨著轉基因小鼠的研究不斷成熟，轉基因動物在慢性膽汁淤積致肝纖維化和自身免疫性肝纖維化方面的報道也逐漸增多。目前已發現的相關基因有Mdr2、Tgfbr2、Il2rα、Ae2a,b和NOD.c3e4等。Mdr2編碼膽小管磷脂的P-糖蛋白轉運體，參與膽汁磷脂（磷脂酰膽堿）的排泄。當Mdr2（Abcb4）被敲除，磷脂酰膽堿向膽汁內轉運不足，誘發非膿性膽管炎伴門靜脈炎，引起導管增生，管腔狹窄、阻塞。小鼠自出生起3～6 個月，可出現硬化性膽管炎合并肝纖維化及肝細胞癌[9]。原發性硬化性膽管炎系慢性膽汁淤積性肝病，以病理性免疫介導引起肝內小葉間膽管炎為特征，肝內、外膽管系統出現進行性炎癥和纖維化。機體血清抗線粒體抗體陽性，肝內大膽管呈現節段性擴張與縮窄，導致局部膽管狹窄甚至閉塞，膽管出現多病灶狹窄，誘發肝纖維化，最終導致肝硬化[10]。在肝星狀細胞活化、細胞外基質增多等過程中，轉化生長因子β 發揮重要作用[11]。顯性負性突變轉化生長因子βⅡ受體轉基因小鼠，因CD4 啟動子處的轉化生長因子βⅡ受體被抑制，其外周免疫耐受被破壞，誘發自體免疫反應，最終引起膽管炎癥疾病。小鼠一般5～6 周發病，表現出淋巴細胞性肝浸潤伴門靜脈周圍炎，肝內膽小管漸進性損傷，與人原發性膽管炎的組織學改變相似[12-13]。此外，Il2rα、Ae2a,b敲除小鼠以及NOD.c3e4小鼠也都能誘發自身免疫病，引起廣泛的門靜脈炎癥反應，CD4+、CD8+等浸潤增多，均能模仿人類原發性膽管炎變化[14-16]。

1.3 免疫誘導法

膽管損傷也可以通過給予免疫誘導劑，引起小鼠自身免疫反應，誘發免疫性膽管損傷、阻塞，引起膽汁淤積。如2-辛基酸偶聯牛血清白蛋白磷酸鹽溶液，加入含H37RA 結核分枝桿菌全弗氏佐劑充分混合后，小鼠腹腔注射給藥，8 周后可出現明顯改變[17-18]。

1.4 改良飼料法

通過飼喂改良后的飼料或添加劑，也可以誘導小鼠引起膽汁淤積肝臟損傷模型。如3，5-二乙氧基羰基-1，4-二氫二氫吡啶（DDC）和α-萘異硫氰酸鹽（ANIT）。每日給予小鼠含0.1%DDC 飼料，1 周后在膽管上皮細胞中可見血管細胞黏附的表達分子、骨橋蛋白和腫瘤壞死因子-α 上調。持續8 周導致膽卟啉增多，膽管周圍肌成纖維細胞活化，引起膽道纖維化與人類硬化性膽管炎相似[19]。每日給予小鼠0.025% ANIT，飼喂數天后，就可引起膽汁淤積性損傷，引起膽管上皮細胞損傷，膽管上皮擴張，輕度肝細胞損傷和門靜脈周圍炎癥導致肝纖維化[20]。

2 毒物誘導致肝纖維化

2.1 CCl4

CCl4法是用于復制肝臟損傷模型的常用方法。CCl4誘導小鼠肝臟損傷，進一步發展即可成為纖維化模型，是較為經典的早期肝纖維化模型復制方法。CCL4模型復制方法成熟，成功率高達89.33%，簡單易行、經濟安全。一般從第2 周開始，就可出現不同程度肝纖維化程度，平均4.9%，至第8 周可達到平均9.2%的纖維化，能很好地模擬人類肝纖維化S0～S4 期的病理特征，且與乙肝病毒感染所致肝纖維化的病理特征相似[21-22]。該方法現已廣泛應用于研究小鼠肝纖維化發生機制、篩選血清標志物以及開發抗纖維化藥物等。但該方法由于CCl4處理后的肝毒性劇烈，小鼠的死亡率較高，同時還有恢復的可能。總體來說，該方法在某種程度上基本可以滿足實驗需求，同時也需要改進來彌補缺點。

2.2 DMN

DMN 具有肝毒性，能引起肝損傷并可導致肝纖維化，并具有致突變和致癌性[23]。注射DMN 2 周后，就可出現明顯的肝纖維化（3.72%），第4 周時，肝纖維化程度為3.73%[24]。該方法操作簡單，模型復制時間短，纖維化程度穩定。但由于DMN 的毒性，該方法存在小鼠死亡率較高等弊端，同時，由于DMN 的強揮發性，工作人員應注意防護。

2.3 TAA

300 mg/kg 腹腔注射TAA，2 次/周，共8 周[25]，或者將TAA 按200 mg/L 加入小鼠飲用水中，日常飲用[26]。即可見中心小葉壞死，轉氨酶活性升高，肝纖維化加重。該模型成功率高且穩定，藥物中斷后肝纖維化不易恢復，但TAA 是一種弱致癌物，毒性大易揮發，使用過程中應注意。

3 代謝性肝纖維化

長期高脂飲食或以特殊飼料喂養小鼠，可引起肝臟脂肪樣變，引起肝臟纖維化甚至肝硬化。如小鼠以蛋氨酸-膽堿缺乏飼料喂養8 周后，可見明顯大泡性肝細胞脂肪變、小葉內炎細胞浸潤、肝細胞呈點灶狀壞死以及竇周區纖維化等[27]，產生非酒精性脂肪肝，引起肝纖維化。此外膽堿缺乏、膽堿缺乏乙硫氨酸供給等也可引起非酒精性脂肪肝導致肝纖維化。

4 酒精性肝纖維化

肝臟是乙醇代謝的主要器官，在乙醇代謝過程中，肝臟NADH/NAD+比率的變化、脂肪積蓄以及脂質過氧化物堆積，均能引起肝細胞損傷。小鼠用56%乙醇自由喂養4～7 周，結果顯示小鼠肝細胞出現明顯脂肪變性，肝臟形成纖維化[28]。該模型一般較多運用于酒精性肝病相關研究。

5 免疫性肝纖維化

免疫性肝纖維化通過注射抗原，激發小鼠自身免疫過程，形成免疫復合物，沉降于匯管區，刺激肝星狀細胞活化，生成肌成纖維細胞，分泌大量膠原沉積致纖維化。該模型是基于免疫反應引起纖維化，故主要用于評估與分析藥物在免疫性肝纖維化中的作用與機制[8]。Con A 常用于誘導免疫性肝纖維化，通過激活T 細胞分泌大量細胞因子，引發特異性肝損傷，肝實質可見大量淋巴細胞（CD4+T 淋巴細胞為主）浸潤[29]，肝損傷進一步發展，形成肝纖維化。Con A 誘導肝纖維化特征與人類病毒感染致肝纖維化病理特征更接近[30]。

此類模型是一種免疫性損傷，模型復制方法較穩定、成功率高、對動物其他器官損傷較輕且纖維化持續時間長。但此類動物免疫性肝損傷模型缺乏人類病毒感染持續復制階段以及人類肝臟實質持續損傷的病理過程。

6 血吸蟲致肝纖維化

血吸蟲尾蚴可用來制備肝纖維化模型[31]。血吸蟲尾蚴可在腸系膜靜脈系統發育為成蟲，雌蟲釋放蟲卵進入肝臟后，分泌可溶性蟲卵抗原，誘發宿主機體病理性免疫應答，繼發肝纖維化過程。感染4 周后肝臟肉芽腫增生、腫大，自第6 周開始即可見中心靜脈變性壞死，門脈區結締組織增生、擴大，肝小葉內被增生的結締組織間隔成肝細胞團，逐漸形成肝纖維化。此模型一般僅用于血吸蟲病性肝纖維化及肝硬化的藥物治療研究，不適用于肝纖維化的一般研究。

7 總結

理想的肝纖維化模型應與人類疾病的發生、發展特征相似，且在動物實驗過程應符合3R 原則，這就要求動物實驗應該實驗方法穩定、成模率高、重現性好。迄今為止，利用實驗動物復制肝纖維化模型的方法較多，但都各有利弊。目前，尚無某一模型復制方法能完全模擬人類發病過程，這與人和動物種屬差異大、肝纖維化致病原因復雜有關。CCl4與DMN 這兩種化學藥劑由于材料容易得到，模型復制周期短，并且無需做大量生物學上的準備工作，更容易被接受。但與此同時，化學藥劑引發的肝臟反應，并不是人類實際的發病原因。免疫模型復制方法相比于其他方法更加接近臨床情況，與人類肝纖維化情況類似，但由于誘發因子的抗原性溫和，纖維化程度都不高，動物也沒有人類病毒感染過程中病毒持續復制以及肝臟實質持續受損的過程。此外，我國臨床中肝纖維化的誘因仍以慢性病毒感染引起為主，但多數實驗動物對肝炎病毒易感性低，不易成模。故未來肝臟纖維化動物模型應著眼于模擬人類因肝炎病毒長期感染，以期對此類患者發病機制及治療藥物的篩選提供更多支持。